前  言

一、專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的能力。專屬性是大多數(shù)分析方法中最重要的指標(biāo)，是建立分析方法首先要考慮的問(wèn)題。色譜法中常見(jiàn)的專屬性考察指標(biāo)為分離度。

在分析方法驗(yàn)證過(guò)程中，有很多方法來(lái)考察專屬性：

（1）分離度考察（各起始物料、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物、主成分、空白輔料、溶劑），對(duì)于有關(guān)物質(zhì)而言，已知雜質(zhì)或降解產(chǎn)物應(yīng)加入到新配制的含活性成分的溶液中，確保與被測(cè)定峰完全分離，主峰與相鄰雜質(zhì)，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間的分離度應(yīng)大于1.5（方法開(kāi)發(fā)時(shí)可以規(guī)定大于2），有時(shí)在標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定采用相對(duì)保留時(shí)間的方法確定某個(gè)雜質(zhì)，那么在專屬性考察中應(yīng)統(tǒng)計(jì)相對(duì)保留時(shí)間，并注意在其他驗(yàn)證項(xiàng)目中也進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

（2）降解試驗(yàn)（光照、高溫、高濕、酸堿水解、氧化）或加速試驗(yàn)中的樣品。

（3）采用PDA（或DAD）檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器（MS）進(jìn)行峰純度檢查。

（4）改變方法中的某個(gè)條件進(jìn)行驗(yàn)證（如在等度洗脫后增加有機(jī)相比例，考察有無(wú)未洗脫下來(lái)的新雜質(zhì)；采用CAD檢測(cè)器等考察無(wú)UV吸收的其他雜質(zhì)峰）。

（5）考察未精制的粗品，并與最終精制過(guò)的成品進(jìn)行雜質(zhì)譜對(duì)比，根據(jù)粗品中各成分的分離度和樣品中可能出現(xiàn)雜質(zhì)來(lái)優(yōu)化色譜參數(shù)。

（6）代表性制劑樣品（制劑工藝中可能新增其他雜質(zhì)）。

上述方法中，值得討論的是降解試驗(yàn)。指導(dǎo)原則中沒(méi)有關(guān)于降解條件的特別規(guī)定，因此做法各不相同。通常，原料藥的強(qiáng)制降解試驗(yàn)包括液態(tài)的和固態(tài)的情況（應(yīng)包括酸/堿水解，高溫，高濕，氧化和光照），僅通過(guò)原料藥的溶液或固體的降解一般無(wú)法準(zhǔn)確推斷制劑中藥物的降解情況，因?yàn)橹苿┲械姆腔钚猿煞郑ㄝo料）也可能與原料藥反應(yīng)或催化降解反應(yīng)。對(duì)于制劑，常用試驗(yàn)條件為高溫、高濕和光照。制劑的降解很大程度決定于該制劑是溶液還是固體。對(duì)于固體制劑，主要試驗(yàn)是高溫、高濕和光照降解，最常見(jiàn)的反應(yīng)類型是水和原料藥的反應(yīng)，因此高溫和高濕組合試驗(yàn)也很關(guān)鍵。制劑降解中需同時(shí)進(jìn)行空白輔料的降解試驗(yàn)。

降解程度通常是使主成分有5%~20%的降解（主峰剩余80%~95%），盡量不要讓降解超過(guò)20%，如果超過(guò)20%，則應(yīng)改變降解強(qiáng)度和/或時(shí)間。避免使用高濃度或劇烈的破壞條件，盡量使用低濃度、長(zhǎng)時(shí)間的條件進(jìn)行降解。因?yàn)楫?dāng)使用劇烈條件時(shí)可能出現(xiàn)次級(jí)降解，藥物的降解機(jī)理可能會(huì)發(fā)生改變。

酸降解：酸降解可以通過(guò)在樣品溶液中或固體（原料藥或制劑）中加入0.1mol/L鹽酸溶液進(jìn)行，條件可以在室溫或60℃條件下最長(zhǎng)放置3天。

堿降解：堿降解可以按照酸降解的方式進(jìn)行，如0.1mol/L氫氧化鈉，二者均應(yīng)采用相應(yīng)的酸堿溶液進(jìn)行中和。

氧化降解：親核氧化反應(yīng)可以在樣品溶液中或固體（原料藥或制劑）中加入稀過(guò)氧化氫溶液（如3%），在室溫下反應(yīng)24h進(jìn)行，可能產(chǎn)生N-氧化物或亞砜雜質(zhì)。自由基氧化可以使用偶氮二異丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN）來(lái)進(jìn)行研究，在40℃下反應(yīng)1-3天。應(yīng)根據(jù)藥物的氧化降解機(jī)理選擇適當(dāng)?shù)难趸瘎?/p>

高溫降解：高溫降解試驗(yàn)可以采用樣品溶液中或固體（原料藥或制劑）在高溫下進(jìn)行，典型條件是在60°C 進(jìn)行24-48 h, 基于貯藏條件，其他室溫以上的條件也可以采用。

光照降解：高溫降解試驗(yàn)可以采用樣品溶液中或固體（原料藥或制劑）,試驗(yàn)條件可根據(jù)ICHQ1B中的光源應(yīng)包括可見(jiàn)光和紫外光。

如果化合物難溶于水，可加入其他助溶劑使其在鹽酸或氫氧化鈉溶液中或過(guò)氧化氫溶液中溶解。助溶劑的選擇應(yīng)基于藥物的結(jié)構(gòu)。兩種最常用的共溶劑為乙腈和甲醇。但應(yīng)當(dāng)注意的是，由于受諸多因素的影響，通過(guò)助溶劑增加溶解度并非都能加速降解。選擇合適的共溶劑時(shí)應(yīng)特別關(guān)注藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。應(yīng)能夠識(shí)別藥物結(jié)構(gòu)中易反應(yīng)的化學(xué)位點(diǎn)，切勿選擇能與藥物發(fā)生反應(yīng)的共溶劑。例如，當(dāng)藥物結(jié)構(gòu)中含有羧酸、酯鍵、酰胺鍵、芳香胺或羥基時(shí)，應(yīng)避免使用甲醇和其他醇類作為共溶劑進(jìn)行酸降解試驗(yàn)。這樣會(huì)避免因藥物與甲醇或其他醇類反應(yīng)導(dǎo)致的不必要的研究工作。另外，只有當(dāng)乙腈比例為20%或更低時(shí)才可與1N NaOH溶液混合，NaOH濃度降低至0.1N時(shí)可以使用更高比例的乙腈作為共溶劑。乙腈是最常用的共溶劑。

對(duì)于制劑而言，高溫、光、濕（RH70%或80%）、高溫+高濕是很重要的，因?yàn)檫@些條件更能夠模擬今后制劑中遇到的實(shí)際情況，發(fā)現(xiàn)這些條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)可以提前做出是否需要增加這些雜質(zhì)研究的判斷。例如，作者曾在高溫高濕條件下發(fā)現(xiàn)有三個(gè)新增雜質(zhì)，對(duì)過(guò)期的參比制劑以及經(jīng)過(guò)加速試驗(yàn)的參比制劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的雜質(zhì)與高溫高濕條件一致。

目標(biāo)化合物色譜峰的峰純度是專屬性的一個(gè)重要考察指標(biāo)，使用光譜檢測(cè)器進(jìn)行專屬性評(píng)價(jià)的原理見(jiàn)下圖，以色譜法和紫外-可見(jiàn)二極管陣列檢測(cè)器為例。圖中顯示了一個(gè)專屬性色譜方法和一個(gè)非專屬性色譜方法。兩個(gè)色譜峰看起來(lái)非常相似。從峰形來(lái)看，無(wú)法明顯看出該色譜峰中包含一個(gè)或幾個(gè)化合物。這兩個(gè)例子中，分別在色譜峰的上行和下行處查看其UV 光譜圖，歸一化后進(jìn)行比較。左例中，光譜圖是相同的，表明該色譜峰中只有一個(gè)化合物，或者說(shuō)該色譜峰是光譜純的。右例中，兩個(gè)UV 光譜圖不同，由此證明該色譜峰顯然不純?，F(xiàn)在二極管陣列檢測(cè)器能夠?qū)庾V圖進(jìn)行自動(dòng)比較，進(jìn)行峰純度評(píng)價(jià)。

當(dāng)共洗脫化合物的光譜圖非常接近時(shí)，紫外-可見(jiàn)二極管陣列檢測(cè)器就有其局限性，這種情況下，最好為HPLC 配一個(gè)質(zhì)譜檢測(cè)器。質(zhì)譜通常比紫外光譜專屬性更強(qiáng)，因此常用于色譜的選擇性評(píng)價(jià)。一個(gè)HPLC 與質(zhì)譜配合使用的例子見(jiàn)下圖。對(duì)于4.86 分鐘洗脫的色譜峰，在不同部位采集的質(zhì)譜圖不同，顯示該色譜峰不純。

如果文獻(xiàn)報(bào)道藥物在各條件下都比較穩(wěn)定，并且在所設(shè)計(jì)的劇烈條件下降解仍達(dá)不到5%或10%，則沒(méi)有必要再繼續(xù)進(jìn)行降解?？傊?，降解試驗(yàn)不應(yīng)為了降解而降解，最好能夠模擬制劑加速條件或以后可能遇到的劇烈條件，即具有一定的穩(wěn)定性指示作用是最好的。如某藥物對(duì)光敏感，那么在進(jìn)行降解試驗(yàn)是應(yīng)考察固體和溶液哪個(gè)更敏感、對(duì)什么光敏感、采用的避光措施能否有效避光等。

在經(jīng)過(guò)定位研究及降解試驗(yàn)研究后，一旦證明方法的專屬性符合要求，那么此時(shí)方法中的色譜柱、流動(dòng)相組成、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)就可以基本確定下來(lái)，以后可以在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進(jìn)行摸索和優(yōu)化。值得注意的是，有時(shí)色譜圖中顯示相鄰兩個(gè)色譜峰的分離度為1.5，雖然數(shù)據(jù)上符合要求，但放大觀察后可能會(huì)發(fā)現(xiàn)二者并不能完全分離，此時(shí)最好繼續(xù)優(yōu)化條件使雜質(zhì)的分離度大于2，以免后期出現(xiàn)問(wèn)題。

二、準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度系指所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率（%）表示?；厥章蕬?yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)試驗(yàn)。

在本指導(dǎo)原則中，準(zhǔn)確度的數(shù)據(jù)中有一定變化，例如將同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）6份供試品的方法刪掉了，只保留了3種不同濃度，每種濃度分別制備3份溶液，共9份樣品的測(cè)定方法。

對(duì)于化學(xué)藥，將配制方法中的推薦比例也刪掉了。

樣品中待測(cè)成分含量和回收率限度關(guān)系可參考下表，在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。

在方法學(xué)驗(yàn)證中，對(duì)于原料藥的含量測(cè)定回收率而言，應(yīng)采用已知含量（真值）的對(duì)照品配制三種不同濃度，每個(gè)濃度三份，共九份進(jìn)行測(cè)定，九份結(jié)果的平均值作為最終結(jié)果（測(cè)定值），并將其與其他方法測(cè)得的結(jié)果或與對(duì)照品報(bào)告單上的結(jié)果進(jìn)行比較，如果基本一致，說(shuō)明方法準(zhǔn)確性很高。對(duì)于原料藥中的雜質(zhì)而言，可在原料藥中加入50%限度、100%限度、150%限度、200%限度的雜質(zhì)對(duì)照品，每個(gè)濃度配制三份，進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)于制劑含量測(cè)定而言，可以在處方量空白輔料中加入不同量的對(duì)照品，例如正常分析中被測(cè)物含量的80%、100%、120%，對(duì)于溶出度、含量均勻度、雜質(zhì)測(cè)定而言，可以在空白輔料或樣品中加入一定比例的對(duì)照品或雜質(zhì)對(duì)照品，濃度范圍包括藥典中推薦的范圍，對(duì)于雜質(zhì)而言一般為50%限度、100%限度、150%限度、200%限度，根據(jù)測(cè)定總量、加入量和樣品中原有量，計(jì)算回收率百分比。

雜質(zhì)回收率的計(jì)算時(shí)，如果最終標(biāo)準(zhǔn)是加校正因子的主成分自身對(duì)照法，應(yīng)采用確定的方法計(jì)算回收率。同時(shí)，可以驗(yàn)證外標(biāo)法和加校正因子的主成分自身對(duì)照法兩種方法的測(cè)定結(jié)果是否一致，并將這兩種方法的計(jì)算結(jié)果均列入方法學(xué)驗(yàn)證資料中。

如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。但應(yīng)注意，在加樣回收率試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)，加入的對(duì)照品量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

在測(cè)定雜質(zhì)回收率時(shí)，通常是配制一份雜質(zhì)母液，然后在供試品中按設(shè)計(jì)的百分比濃度加入，如果雜質(zhì)的線性與回收率先后在這臺(tái)儀器上進(jìn)行，那么可將線性試驗(yàn)中雜質(zhì)的峰面積與回收率試驗(yàn)中雜質(zhì)的峰面積進(jìn)行對(duì)比，直觀考察基質(zhì)效應(yīng)（輔料影響）、以及溶液制備過(guò)程對(duì)準(zhǔn)確度的影響，如有影響，應(yīng)分析原因，提高回收率。

三、精密度

精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度。

重復(fù)性試驗(yàn)具體做法為：在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少測(cè)定6份的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

對(duì)含量測(cè)定而言，通常重復(fù)性按照第一種方法配制6份相同濃度的供試品溶液，由一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測(cè)試。中間精密度是由不同人員，在不同時(shí)間按照重復(fù)性的方法采用同一批樣品配制6份相同濃度的供試品溶液，最后統(tǒng)計(jì)兩次共12份含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差。重復(fù)性和中間精密度應(yīng)符合下表規(guī)定。

對(duì)于有關(guān)物質(zhì)的重復(fù)性和中間精密度考察，除了應(yīng)統(tǒng)計(jì)上表中規(guī)定的RSD外，也應(yīng)考慮各樣品的雜質(zhì)數(shù)量、雜質(zhì)總量，有時(shí)雜質(zhì)檢出很小時(shí)會(huì)統(tǒng)計(jì)雜質(zhì)的極差，如果極差小于0.02%（或限度的20%）也可以認(rèn)為無(wú)明顯差異，說(shuō)明方法精密度良好。

重現(xiàn)性是考察不同實(shí)驗(yàn)室間的精密度，可以在方法轉(zhuǎn)移中進(jìn)行評(píng)估。

值得注意的是，較高的精密度往往受到玻璃儀器、轉(zhuǎn)移、稱量、稀釋、過(guò)濾等因素的制約，因此過(guò)程中應(yīng)特別注意規(guī)范操作。

四、檢測(cè)限和定量限

檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限沒(méi)有定量意義。定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)確定方法的定量限。

指導(dǎo)原則中規(guī)定了三種方法測(cè)定檢測(cè)限和定量限：

（1）直觀法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢出（或定量測(cè)定）的最低濃度或量。

（2）信噪比法：用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣檢出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢出（或定量）的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比3:1或2:1時(shí)（或10:1）相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限（或定量限）。

（3）基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法。按照LOD=3.3δ/S或LOQ=10δ/S公式計(jì)算，式中LOD為檢測(cè)限，LOQ為定量限，δ為響應(yīng)值的偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。其中δ可以通過(guò)以下方法獲得：①測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)代替。

方法學(xué)驗(yàn)證中，應(yīng)在申報(bào)資料中說(shuō)明是采用上述何種方法來(lái)測(cè)定檢測(cè)限或定量限的。

對(duì)于目測(cè)法而言，需要提供逐級(jí)稀釋的圖譜，并說(shuō)明稀釋過(guò)程。如下圖采用采用初始濃度0.4ng/ml逐級(jí)稀釋，最后目測(cè)觀察0.10ng/ml的濃度相當(dāng)于檢測(cè)限濃度。

檢測(cè)限和定量限常采用信噪比法測(cè)定。該計(jì)算方法下的檢測(cè)限與定量限是通過(guò)對(duì)照品逐級(jí)稀釋的方法獲得的，沒(méi)有考慮任何樣品制備步驟的影響，因此其值往往比分析方法本身的實(shí)際檢測(cè)限與定量限低，而且每臺(tái)儀器也不一樣，因此信噪比法是用來(lái)考察儀器本身性能的，與方法本身的檢測(cè)限或定量限還是不一樣的。信噪比法受到的影響因素比較多，例如所用色譜柱的柱效、檢測(cè)器的氘燈壽命等。例如，下圖中峰形尖銳的信噪比高，s/n=11，此時(shí)檢測(cè)限和定量限都較低。

盡管信噪比法有諸多問(wèn)題，但目前仍是方法學(xué)驗(yàn)證中最常用的計(jì)算方法。有時(shí)，為了保證方法的靈敏度，有時(shí)可采用靈敏度較差的PDA/DAD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)限和定量限的考察。

通常檢測(cè)限應(yīng)低于限度的1/30，定量限應(yīng)低于限度的1/10，如果達(dá)不到這一要求，可適當(dāng)放寬，只要規(guī)定定量限應(yīng)比ICH規(guī)定的雜質(zhì)的報(bào)告限低即可（例如50%報(bào)告限）。

由于靈敏度受儀器、色譜柱、試劑、泵系統(tǒng)、檢測(cè)器等的影響很大，因此為了保證方法的檢測(cè)能力，有些藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了靈敏度溶液的信噪比作為系統(tǒng)適用性要求來(lái)考察整個(gè)色譜系統(tǒng)的靈敏度，相信這種方法以后會(huì)應(yīng)用越來(lái)越多。

在指導(dǎo)原則中還有一句話很重要：“上述方法獲得的檢測(cè)限和定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。”如何進(jìn)行檢測(cè)限和定量限的驗(yàn)證呢？常見(jiàn)的做法是采用雜質(zhì)加標(biāo)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，例如在供試品溶液中加入相當(dāng)于檢測(cè)限或定量限濃度的雜質(zhì)，考察加入后的色譜圖中信噪比是否符合要求。定量限的精密度驗(yàn)證目前基本都做到了，常采用配制6份定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液雜質(zhì)峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于5.0%的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。有時(shí)也進(jìn)行定量限濃度的準(zhǔn)確度驗(yàn)證，可接受限度可參考上述準(zhǔn)確度項(xiàng)下的規(guī)定，有時(shí)也可以適當(dāng)放寬。

對(duì)于滴定方法而言，不必驗(yàn)證方法的檢測(cè)限和定量限，而應(yīng)更重視方法的準(zhǔn)確性、精密度和專屬性。

五、線性

線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的程度。在9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中規(guī)定了兩種測(cè)定方法：

（1）同一對(duì)照品溶液稀釋

（2）分別配制對(duì)照品溶液

并規(guī)定至少采用5種不同濃度進(jìn)行試驗(yàn)，以響應(yīng)信號(hào)作為與被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，首先觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。用于結(jié)果計(jì)算的線性回歸方程其截距不得明顯偏離零點(diǎn)。如果得到一個(gè)顯著的非零截距，應(yīng)證明其對(duì)方法準(zhǔn)確度沒(méi)有影響。對(duì)于化學(xué)藥的含量測(cè)定，線性試驗(yàn)可接受范圍為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的2%以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。對(duì)于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，線性試驗(yàn)可接受范圍為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.990，Y軸截距應(yīng)在100%響應(yīng)值的25%以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于10%。

方法（1）采用同一對(duì)照品溶液（貯備液）進(jìn)行系列稀釋，與分別配制幾種濃度的對(duì)照品分別進(jìn)樣相比能夠減少誤差，因此是做線性的首選方法。

在進(jìn)行雜質(zhì)研究中，經(jīng)常要測(cè)定校正因子校正因子，目前首選方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法：精密稱取雜質(zhì)對(duì)照品和主成分對(duì)照品，分別制備系列溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣后，按最小二乘法以進(jìn)樣量對(duì)響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。由于從定量限到標(biāo)準(zhǔn)限度往往超過(guò)一個(gè)或多個(gè)數(shù)量級(jí)，此時(shí)通過(guò)最小二乘法存在一定的缺陷，高濃度對(duì)結(jié)果的影響很大，分段進(jìn)行計(jì)算時(shí)，往往低濃度不呈線性。因此，此時(shí)藥典中規(guī)定的首先觀察就很有意義，如果明顯不呈線性，計(jì)算出的結(jié)果也是不對(duì)的。除了觀察之外，也可以采用低濃度點(diǎn)的峰面積對(duì)濃度計(jì)算單濃度點(diǎn)的校正因子，如果真的呈線性，那么每個(gè)點(diǎn)的校正因子應(yīng)基本一致，如果差異很大說(shuō)明是“假線性”。上述內(nèi)容可以用下圖來(lái)比較直觀的說(shuō)明。

校正因子的驗(yàn)證試驗(yàn)很重要，在測(cè)定時(shí)應(yīng)至少采用上述線性方法重復(fù)測(cè)定三次校正因子，比較三次結(jié)果的一致性。如參考了藥典標(biāo)準(zhǔn)條件，應(yīng)將實(shí)測(cè)的校正因子與藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的校正因子進(jìn)行對(duì)比。

六、范圍

范圍系指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。

范圍推薦值

七、耐用性

耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。

耐用性通常對(duì)應(yīng)ICHQ2指導(dǎo)原則中的Robustness，這種改變是微小的、故意對(duì)方法本身參數(shù)進(jìn)行的改變，考察對(duì)結(jié)果的影響，在方法開(kāi)發(fā)階段、預(yù)驗(yàn)證階段就應(yīng)進(jìn)行考察。如不同流動(dòng)相組成、不同品牌色譜柱、不同檢測(cè)波長(zhǎng)、不同pH、不同柱溫、不同流速、不同進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。常見(jiàn)的改變包括：考察流動(dòng)相比例變化±5％、流動(dòng)相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、檢測(cè)波長(zhǎng)變化±2nm、流速相對(duì)值變化±20%以及采用三根不同品牌的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，考察系統(tǒng)適用性和樣品測(cè)定結(jié)果的變化。

此外，耐用性還應(yīng)包括Ruggedness，即方法在實(shí)際應(yīng)用條件下結(jié)果的重現(xiàn)性。這些影響因素包括不同分析人員、不同實(shí)驗(yàn)室、相同廠家相同品牌不同批號(hào)色譜柱、新色譜柱、不同品牌儀器、不同廠家的化學(xué)試劑等。這些變量在以后方法使用中更為重要，因此也應(yīng)該在方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證階段就重視。在方法轉(zhuǎn)移階段，方法的ruggedness應(yīng)該特別關(guān)注，并與同批樣品之前的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。在后期方法使用的過(guò)程中，ruggedness會(huì)經(jīng)歷大量的檢驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)，應(yīng)注意問(wèn)題匯總。例如，如果發(fā)現(xiàn)相同品牌不同批號(hào)的色譜柱有影響，就應(yīng)該保存好這些“好”的色譜柱，多從廠家采購(gòu)相同批號(hào)的色譜柱，以避免以后可能出現(xiàn)的問(wèn)題。

最后，溶液的穩(wěn)定性、樣品前處理方法、流動(dòng)相的穩(wěn)定性等也應(yīng)進(jìn)行考察。通常對(duì)照品溶液、供試品溶液都要考察溶液穩(wěn)定性，一般而言，24小時(shí)內(nèi)的溶液穩(wěn)定性是需要考察的。對(duì)于室溫下不穩(wěn)定的，可以選擇冰箱內(nèi)保存（2-8℃）。對(duì)于含THF的流動(dòng)相容易被氧化，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。某些磷酸鹽或醋酸鹽在夏天時(shí)會(huì)因?yàn)槲⑸锷L(zhǎng)，因此應(yīng)不宜使用過(guò)長(zhǎng)。

八、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

《中國(guó)藥典》2020年版編制大綱要求“加強(qiáng)方法中系統(tǒng)適用性試驗(yàn)研究并在標(biāo)準(zhǔn)中予以體現(xiàn)，提高方法的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性”，但在本通則征求意見(jiàn)稿中沒(méi)有明確規(guī)定需要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)研究和驗(yàn)證，僅在耐用性項(xiàng)下規(guī)定：測(cè)定條件小的變動(dòng)應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法的可靠性。目前，在方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證的過(guò)程中，存在著對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)認(rèn)識(shí)和研究不足、缺少重視的情況，應(yīng)引起重視。關(guān)于“系統(tǒng)適用性試驗(yàn)研究”的一些思考一文可結(jié)合本文一起閱讀。

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