自身抗體(autoantibody)是指針對自身組織、器官、細(xì)胞、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)、體內(nèi)蛋白分子等所有自身抗原的抗體總稱^[1]，其本質(zhì)為機(jī)體B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白^[2]。自身抗體分為生理性自身抗體(或稱天然自身抗體)和病理性自身抗體^[3]，后者即為通常講的自身抗體^[4]。據(jù)報(bào)道，目前發(fā)現(xiàn)的自身抗體達(dá)數(shù)百種^[5]，目前臨床常規(guī)檢測自身抗體項(xiàng)目約80種，主要包括抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)及其抗體譜、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophilcytoplasmic antibody，ANCA)及其抗體譜、抗磷脂抗體譜、自身免疫肝病抗體譜及肌炎抗體譜等。近年來，隨著抗體篩選技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的自身抗體被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用范圍除自身免疫性疾病外，已拓展至消化、生殖及腫瘤等領(lǐng)域^[6]。自身抗體檢測種類及數(shù)量爆發(fā)式增長，自身抗體檢測市場欣欣向榮，但同時(shí)也帶來不少問題，現(xiàn)對自身抗體檢測的問題和對策作一探討。

自身抗體相關(guān)概念問題包括自身抗體命名及其檢測方法兩個(gè)方面。

1．自身抗體命名：

自身抗體命名并無專門機(jī)構(gòu)統(tǒng)一管理，而由各學(xué)者自由發(fā)揮，如對于傳統(tǒng)的抗SSA抗體，其本質(zhì)為干燥綜合征(sj?gren syndrome，SS)患者發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)抗體。隨著抗原重組純化技術(shù)的發(fā)展，可檢測到抗SSA抗體的兩個(gè)亞單位，即抗SSA/Ro60抗體和抗SSA/Ro52抗體，兩種抗體與SS的關(guān)系如何？臨床出具的報(bào)告為抗SSA抗體，其具體指那種？這給臨床醫(yī)生造成極大的困惑，實(shí)際上傳統(tǒng)的抗SSA抗體即指抗Ro60抗體，而抗Ro52抗體與SS沒有太大關(guān)系^[7]。再如，ANA譜及ENA抗體譜的概念問題，ANA譜是指針對明確純化抗原抗體的集合，其與傳統(tǒng)的ENA抗體譜有所不同，傳統(tǒng)ENA抗體譜檢測通常采用磷酸鹽緩沖液提取動物胸腺細(xì)胞核蛋白作為抗原底物^[8]。但由于核成分中的DNA和組蛋白等堿性成分無法被磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2)提取，因此，傳統(tǒng)ENA抗體譜并未包括抗DNA和抗組蛋白抗體。而目前，仍有很多學(xué)術(shù)文章、專著及檢驗(yàn)報(bào)告等均會出現(xiàn)兩者概念混淆的情況。對于這種問題應(yīng)由專業(yè)學(xué)術(shù)委員會及時(shí)對易造成困惑的問題進(jìn)行澄清和宣講，以提高學(xué)術(shù)界的統(tǒng)一認(rèn)識。還有，目前臨床上檢測的ANCA，由于雜志社或出版社的要求，將'胞漿'統(tǒng)一為'胞質(zhì)'，因此，該抗體具有抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體和抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體兩種命名^[9,10]，這種命名差異也給臨床醫(yī)生和研究學(xué)者造成混亂，部分學(xué)者仍在質(zhì)疑這兩個(gè)抗體是否為同一種物質(zhì)。對于這種命名修改應(yīng)做一定的調(diào)查，以大家統(tǒng)一的認(rèn)知度為準(zhǔn)，然后再確定是否需要修改。

2．自身抗體檢測方法命名：

自身抗體檢測方法越來越多，近年來出現(xiàn)了流式熒光法和化學(xué)發(fā)光法等新型檢測方法。不可否認(rèn)，試劑生產(chǎn)商推廣的檢測方法和產(chǎn)品將帶動自身抗體學(xué)科的發(fā)展。但在一定條件下，出現(xiàn)了試劑生產(chǎn)商引領(lǐng)學(xué)科發(fā)展，有時(shí)對學(xué)科造成很大混亂，如：流式熒光法、懸浮芯片法、multiplex法、液相芯片技術(shù)、多元流式點(diǎn)陣儀等，其實(shí)質(zhì)這些方法大同小異；另外如免疫印跡法、線性印跡法或免疫斑點(diǎn)法等，這些方法也是相同的，由于專家學(xué)術(shù)認(rèn)知不同，這些大同小異的方法卻按不同方法寫入了專著或教材，其負(fù)面影響更深遠(yuǎn)。行業(yè)協(xié)會及出版社應(yīng)該為此負(fù)起審核責(zé)任，避免學(xué)術(shù)混亂。

自身抗體必須采用相應(yīng)的靶抗原進(jìn)行免疫結(jié)合反應(yīng)進(jìn)行檢測，即抗體針對的靶抗原才是核心，因此自身抗體檢測結(jié)果與靶抗原的序列、肽段三級或四級結(jié)構(gòu)，抗原決定簇暴露位置等有關(guān)。不同抗原生產(chǎn)商靶抗原結(jié)構(gòu)會有一定的差異，特別是對于專利保護(hù)的抗原，試劑生產(chǎn)商為了避開專利，對抗原進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造，合成新的抗原，若該抗原決定簇與其他抗原不同或不完全相同，就會造成檢測結(jié)果不相符。如，抗心磷脂抗體檢測對于狼瘡和病態(tài)妊娠的診斷具有重要價(jià)值，但同一患者不同醫(yī)院檢測結(jié)果迥異，臨床醫(yī)生不知該如何處理。此外，由于很多試劑生產(chǎn)商購買第三方的抗原原料進(jìn)行包被加工，出于商業(yè)秘密原因，很多試劑廠商不會告知抗原來源或抗原序列，這為真正的結(jié)果判斷帶來障礙。對于活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化溯源更為困難，臨床上推薦采用HEp-2細(xì)胞底物進(jìn)行ANA檢測，由于細(xì)胞固定前是培養(yǎng)的活細(xì)胞株，對于同一批號的活細(xì)胞存在不同生長周期的細(xì)胞，因此，同一底物片中的細(xì)胞各不相同。而對于不同試劑生產(chǎn)商而言，其細(xì)胞差別會更大，更何況有些細(xì)胞進(jìn)行了改造，如將HEp-2細(xì)胞中導(dǎo)入SSA抗原，以增強(qiáng)檢測抗SSA抗體的能力，這種細(xì)胞稱為HEp-2000細(xì)胞，其與傳統(tǒng)的HEp-2細(xì)胞具有較大差別^[11]。

目前，自身抗體檢測無溯源標(biāo)準(zhǔn)是行業(yè)共認(rèn)的難題。目前國內(nèi)僅有抗甲狀腺球蛋白抗體等少數(shù)自身抗體能購買到相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)品，國外學(xué)者也認(rèn)識到自身抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)化問題，已有Diana等^[12]學(xué)者對抗促甲狀腺受體抗體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比對研究，以盡量實(shí)現(xiàn)結(jié)果可比性。但對于大多數(shù)抗體并無標(biāo)準(zhǔn)品可以參考，目前我國臨床上通常采用市場占有率高及信譽(yù)度高的試劑作為標(biāo)準(zhǔn)，但實(shí)際上，上述標(biāo)準(zhǔn)未必是真正的標(biāo)準(zhǔn)，甚至可能誤導(dǎo)臨床，比較合適的方法應(yīng)該是以臨床診斷患者為標(biāo)準(zhǔn)，以較高的臨床診斷靈敏度和特異性作為試劑評判標(biāo)準(zhǔn)可能是一種目前不得以而求其次的辦法。

目前，自身抗體檢測方法多，主要以熒光法、印跡法及ELISA法為主。以ANA檢測為例，HEp-2細(xì)胞為底物的間接免疫熒光法是推薦檢測方法，但并非所謂的'金標(biāo)準(zhǔn)'方法。而ANA譜通常采用以純化抗原的免疫印跡法或ELISA法進(jìn)行檢測。有很多文獻(xiàn)認(rèn)為前者為篩選性實(shí)驗(yàn)，而后者為確證性實(shí)驗(yàn)，實(shí)際上這種說法欠妥。既然間接免疫熒光法檢測ANA是篩選性實(shí)驗(yàn)，那該方法應(yīng)將所有相關(guān)抗體全部檢測出來，但實(shí)際并非如此，熒光法ANA為陰性但ANA譜[如抗Ro60抗體和(或)抗Jo-1抗體等]可出現(xiàn)陽性，更不能以熒光法檢測ANA陰性，即認(rèn)為ANA譜必為陰性，截至目前也有不少論文表明ANA和ANA譜同時(shí)檢測的必要性^[13]。此外，將ANA譜稱為確診性實(shí)驗(yàn)也不妥，確診性實(shí)驗(yàn)的含義是指該實(shí)驗(yàn)方法能將標(biāo)本中的抗體檢測出來并一定會檢測出來，但鑒于抗原結(jié)合位點(diǎn)及檢測敏感度的問題，任何人都無法保證能將真正的抗體全部檢測出來，因此，在臨床上避免使用這兩個(gè)容易引起誤解的詞匯。

目前自身抗體檢測多為定性或半定量的方法，定量高敏的檢測方法是自身抗體發(fā)展的方向。對于目前出現(xiàn)的兩種檢測方法，即多個(gè)自身抗體同時(shí)檢測(也可單個(gè)檢測)的流式熒光法^[14]和單項(xiàng)自身抗體檢測的化學(xué)發(fā)光法^[15]該如何選擇？兩種檢測方法均為高精度、全自動化大型檢測儀器，但其各具特點(diǎn)，前者一次檢測項(xiàng)目最多達(dá)100多項(xiàng)，但其必須組套項(xiàng)目同時(shí)檢測，對于初診患者而言，確實(shí)可以通過多個(gè)疾病的自身抗體組套，可以很快檢測出相關(guān)疾病的自身抗體，當(dāng)然其檢測費(fèi)用較高，但可以節(jié)約診斷時(shí)間；對于確診患者，通常只需要檢測曾經(jīng)檢測出的陽性的幾個(gè)自身抗體即可，這對于流式熒光法而言，多項(xiàng)檢測將造成資源浪費(fèi)。因此，試劑儀器生產(chǎn)商將會對檢測技術(shù)及檢測成本進(jìn)行競爭，讓臨床能夠得到更多更好的選擇。

準(zhǔn)確的結(jié)果不僅取決于臨床檢驗(yàn)過程，與試劑生產(chǎn)過程也密切相關(guān)。嚴(yán)格來講，自身抗體檢測的標(biāo)準(zhǔn)化包括試劑生產(chǎn)、標(biāo)本檢測及報(bào)告審核等全過程。但由于試劑生產(chǎn)和臨床檢測由不同部門監(jiān)管，因此，此處只討論實(shí)驗(yàn)室檢測的標(biāo)準(zhǔn)化。所謂標(biāo)準(zhǔn)化，即對相關(guān)操作要求均有嚴(yán)格的規(guī)定，但對自身抗體的臨床檢測，其標(biāo)準(zhǔn)化要求顯得比較寬容，但這對于臨床檢測卻是很大的問題。

1．滴度系統(tǒng)：

目前部分自身抗體檢測結(jié)果采用滴度高低表示，滴度越高表明患者體內(nèi)自身抗體濃度越高。以ANA檢測為例，目前采用以HEp-2細(xì)胞為底物的間接免疫熒光法進(jìn)行檢測，但血清起始稀釋度卻各不相同，如1∶80或1∶100等，而且國內(nèi)有兩種滴度體系，即倍比滴度體系(1∶80、1∶160、1∶320、1∶640…)^[16]和滴度體系(1∶100、1∶320、1∶1 000、1∶3 200…)^[17]，同一患者在不同醫(yī)院檢測由于滴度系統(tǒng)不同，結(jié)果無法對應(yīng)，臨床醫(yī)生如何判斷自身抗體濃度趨勢？當(dāng)然患者可以在同一家醫(yī)院進(jìn)行復(fù)診監(jiān)測，但若轉(zhuǎn)診到ANA滴度系統(tǒng)不同的醫(yī)院就必須重新檢測。對于這一問題，行業(yè)協(xié)會和行政管理部門已經(jīng)關(guān)注并制定專家共識^[18]，目前允許兩種滴度系統(tǒng)共存。但從長遠(yuǎn)的角度而言，統(tǒng)一起始稀釋度和滴度系統(tǒng)，通過不同試劑對比找到各自滴度的對應(yīng)平衡點(diǎn)，為結(jié)果統(tǒng)一和報(bào)告互認(rèn)打下基礎(chǔ)，可為國家節(jié)約大量的醫(yī)保經(jīng)費(fèi)。

2．反應(yīng)溫度：

溫度是影響免疫學(xué)反應(yīng)的重要因素。不同的溫度將會導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大的差異。很多實(shí)驗(yàn)室采用手工檢測進(jìn)行自身抗體檢測，即使采用儀器，反應(yīng)環(huán)境也是裸露于室溫當(dāng)中。目前很多試劑盒說明書均要求在'室溫'條件下反應(yīng)，這種彈性要求給自身抗體檢測埋下隱患。在實(shí)際情況下室溫變化很大，不同地區(qū)間的室溫差別更大，對于這一問題，應(yīng)從幾個(gè)方面解決，首先，試劑說明書應(yīng)規(guī)定在確定的溫度下進(jìn)行，但對于裸露的試劑和儀器具體具有挑戰(zhàn)性，要求維持房間恒溫可能不現(xiàn)實(shí)，比較可行的方法是實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行不同溫度下的ANA結(jié)果差異研究，從而調(diào)整不同溫度時(shí)的溫育時(shí)間，通過性能驗(yàn)證找到溫度差異及時(shí)間差異的平衡點(diǎn)，從而制定適合自身?xiàng)l件變化的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程(standard operating procedure，SOP)，嚴(yán)格遵循SOP進(jìn)行日常操作，以減小因溫度差異造成的結(jié)果差異。

3．反應(yīng)時(shí)間：

時(shí)間是影響免疫學(xué)反應(yīng)的另一重要因素。臨床實(shí)踐中，很多實(shí)驗(yàn)室對于反應(yīng)時(shí)間這一要求的執(zhí)行并不嚴(yán)格。以ANA檢測為例，若采用手工加樣檢測，加樣第一點(diǎn)及最后一點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間本身已有差別，第一點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間等于最后一點(diǎn)反應(yīng)時(shí)間加上加樣持續(xù)時(shí)間，對于加樣較慢的技術(shù)人員，這種影響其實(shí)并不小。因此，對于檢測儀器而言，最好設(shè)計(jì)采取每反應(yīng)區(qū)均有相同的反應(yīng)時(shí)間，保證每反應(yīng)區(qū)的反應(yīng)條件的均一性。這種反應(yīng)時(shí)間執(zhí)行不嚴(yán)格還表現(xiàn)在補(bǔ)加熒光標(biāo)記抗體上。在臨床實(shí)踐中，偶然會出現(xiàn)熒光標(biāo)記抗體側(cè)漏到反應(yīng)區(qū)外的情況，對于這種情況，很多實(shí)驗(yàn)室只是將熒光標(biāo)記抗體補(bǔ)上去而已，對于熒光標(biāo)記抗體孵育時(shí)間減少了多少并未關(guān)注，這將會導(dǎo)致自身抗體滴度下降甚至假陰性。對于這一問題，嚴(yán)格以'非立即補(bǔ)加須進(jìn)行復(fù)查'的原則，以保證檢測結(jié)果質(zhì)量。

4．熒光模型判讀：

熒光法檢測自身抗體包括底物片檢測和熒光模型判讀兩個(gè)過程。檢測結(jié)果受方法、試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)等諸多因素影響外，熒光判讀過程的影響其實(shí)更大，影響因素包括熒光顯微鏡的質(zhì)量，技術(shù)人員對圖像的認(rèn)知經(jīng)驗(yàn)，熒光強(qiáng)度的感知，視力的好壞等。目前已有公司開始采用熒光圖像采集，然后通過觀察顯示器上圖像進(jìn)行結(jié)果判讀，這也帶來新的問題，如各公司圖像采集卡的質(zhì)量和參數(shù)不同，顯示器分辨率及顯卡質(zhì)量等存在很大差異，同一圖像在不條件下可以得出完全不同的結(jié)果，這一點(diǎn)值得我們注意。對于上述問題，應(yīng)分兩個(gè)階段解決，第一階段，由于各家實(shí)驗(yàn)室的熒光顯微鏡、圖像采集卡、顯示器及讀片人員均有所不同，之間的差異會比較大，行業(yè)協(xié)會可以采用發(fā)放不同熒光模型不同滴度梯度的血清作為結(jié)果校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，以此為標(biāo)準(zhǔn)制作各實(shí)驗(yàn)室條件下的熒光圖像模型及滴度標(biāo)準(zhǔn)，這樣可以消除硬件及人為主觀因素之間的差異，最后實(shí)現(xiàn)同一血清無論那家實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果均在相同的滴度區(qū)間，當(dāng)然熒光模型越多越全越好。

近年來，自身抗體檢測的進(jìn)展迅速，抗體種類繁多，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。但臨床應(yīng)用過程中，自身抗體項(xiàng)目選擇及應(yīng)用存在一些問題。對于大部分自身抗體而言，對于疾病診斷敏感度不高，即不是所有患者都能檢測到相應(yīng)的自身抗體；特異度也不好，即不是所有陽性抗體均能且只能診斷某一種疾病。很多自身抗體的應(yīng)用共識是：只有患者懷疑某種疾病時(shí)才檢測相應(yīng)的自身抗體，陽性結(jié)果對于疾病診斷具有輔助診斷價(jià)值，陰性結(jié)果則不能排除診斷。臨床實(shí)踐中，商家將太多的自身抗體組合在一起，特別是線性免疫印跡條帶，一人份試劑條可以組套20多個(gè)不同的自身抗體項(xiàng)目，很多情況下，這種組套對于患者而言并不是每個(gè)指標(biāo)都有價(jià)值，從而浪費(fèi)大量的醫(yī)療資源，實(shí)際上，在一定程度上是試劑規(guī)格和項(xiàng)目組合綁架了醫(yī)保制度。對于這一問題，試劑廠商應(yīng)盡量將檢驗(yàn)項(xiàng)目單獨(dú)分裝，若需要組套也應(yīng)以疾病相關(guān)抗體組合在一起，組合項(xiàng)目越少越好。這種作法，對于實(shí)驗(yàn)室檢測而言可能會增加一定工作量，但從國家整體而言，可以節(jié)約大量的醫(yī)保經(jīng)費(fèi)支出。

目前，自身抗體檢測存在諸多問題，包括試劑生產(chǎn)商、儀器供應(yīng)商、檢測人員技術(shù)及認(rèn)識、檢測管理制度等多個(gè)方面。有些問題是表面的，而有些問題是深層次的。解決這些問題應(yīng)經(jīng)過兩個(gè)階段。首先是問題認(rèn)識階段，由于不少人員對自身抗體檢測的問題認(rèn)識不足，在加強(qiáng)認(rèn)識的基礎(chǔ)上集眾人之智慧，在實(shí)際工作過程中盡量避免可以避免的問題；其次是問題解決階段，需對上述問題全面考慮、逐個(gè)解決。國家行政管理部門、國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會及行業(yè)協(xié)會統(tǒng)一組織管理，從試劑準(zhǔn)入、儀器審核、制度規(guī)定、標(biāo)準(zhǔn)制訂、技術(shù)要求上頂層設(shè)計(jì)、統(tǒng)一布署，從根本上高效地解決自身抗體檢測存在的問題，使自身抗體檢測結(jié)果具有精確度更高、可比性更強(qiáng)，檢驗(yàn)人員更有信心，為自身抗體檢測結(jié)果互認(rèn)打下基礎(chǔ)。

選自中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2018,41(12)