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NK細胞的基礎(chǔ)生物學(xué) NK細胞來源于CD34+共淋巴祖細胞。據(jù)估計，NK細胞的半衰期大約為7~10天，它占人類外周血淋巴細胞總數(shù)的10-15%，也存在于脾臟、肝臟、肺、骨髓和淋巴結(jié)中，它們通過與樹突狀細胞(DC)的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)功能。NK細胞是第1組固有淋巴樣細胞的典型成員，聚集在一起，以獲得分泌IFN-γ的能力。終末分化的NK細胞缺乏B(CD 19-)和T(CD3-)淋巴細胞的表型標(biāo)記，CD56是NK細胞特征的標(biāo)志。 通常，它們被區(qū)別出來從其大小，以及含有穿孔素和顆粒酶的細胞質(zhì)顆粒，這是NK細胞殺傷活性的重要效應(yīng)。 NK細胞根據(jù)CD 56的表達水平被進一步區(qū)分：dim 和 bright。CD 56 dim是一種完全成熟的NK細胞，占外周血NK細胞的90%，主要起介導(dǎo)細胞毒性的作用；另一方面，CD 56 Bright是一種不成熟的細胞因子產(chǎn)生的細胞，其溶細胞反應(yīng)有限。NK細胞缺乏基因重排抗原受體，但仍能識別和直接裂解異常轉(zhuǎn)化的細胞，無需事先致敏。這是通過在NK細胞表面表達的一組成熟而獨特的受體來實現(xiàn)的，這些受體通過與被感染和惡變的細胞上的配體相互作用而激活細胞裂解活性。雖然配體仍未完全表征，但NK細胞受體的分類依據(jù)其作用：激活、抑制和混合功能。它們還表達細胞因子受體，包括IL-2受體(R)、IL-4、10、12、15、18和21-R，以及TGF-β受體(TGF-β-R).下圖概述了NK細胞活動的主要受體。 激活受體包括天然細胞毒性受體，由NKp30、44和46組成。NKp30識別帶B7-H6腫瘤抗原，NKp44結(jié)合病毒血凝素和血凝素神經(jīng)氨酸酶以及其他腫瘤相關(guān)配體。NKp 46抑制小鼠轉(zhuǎn)移瘤生長。Fcγ-RIIIa(CD16)是另一種激活受體，可觸發(fā)抗體依賴的細胞毒性（ADCC）。 抑制性受體包括CD161、CLRG1、PD1、TIM3、LAG 3、CD96和TIGIT。具有混合功能的NK細胞受體包括殺傷細胞Ig樣受體(KTR)和NKG2受體：KIR2DS、KIR2B4和KIR3DS與其他具有抑制作用的KIR不同。 同樣，NKG2A受體抑制NK活性，而NKG2D信號傳導(dǎo)激活信號，通過與腫瘤細胞上選擇性表達的特定應(yīng)激誘導(dǎo)配體(MICA、MICB和病毒UL16結(jié)合蛋白)結(jié)合，啟動細胞毒活性。 NK細胞抗腫瘤活性：腫瘤識別和細胞裂解活性 NK細胞對腫瘤細胞具有天然的殺傷作用，也是IFN-γ、TNF-α、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等細胞因子和趨化因子的主要來源。這些細胞因子參與其他造血細胞的招募和功能，例如增強抗原特異性T細胞反應(yīng)，以及與DC和中性粒細胞的調(diào)節(jié)交叉調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。 NK細胞一旦遇到腫瘤細胞，就會啟動溶細胞顆粒的定向外吐，包括釋放穿孔素和顆粒酶，分別穿透細胞質(zhì)膜并觸發(fā)凋亡。這些細胞被NK細胞認(rèn)為是“非自我的”，因為它們的MHC-I的減少/缺乏，而MHC-I在身體幾乎每一個健康的細胞上都有表達。這種選擇性攻擊可以通過一種創(chuàng)造的“耐受性”過程來實現(xiàn)，即成熟的NK細胞表達生殖細胞編碼的抑制受體，識別正常細胞的MHC-I，并觸發(fā)一個抑制信號(通過免疫受體酪氨酸基抑制基)來阻止對這些‘自我’細胞的酪氨酸激活信號。 當(dāng)NK細胞遇到細胞異常缺乏/MHC-I減少時，抑制性受體不被激活，激活信號仍未被抑制，從而引發(fā)裂解攻擊。建立“自我”耐受性的原因是“NK許可”過程，即在NK細胞功能發(fā)育過程中，NK細胞上的抑制受體與其同源的MHCⅠ類配體配對，從而賦予對自身抗原的耐受性。 這一過程與表達自MHCⅠ類特異性受體的功能能力強的NK細胞有關(guān)，而不表達這種受體的細胞沒有獲得許可，也不需要受到MHC I類的抑制，因為它們在功能上沒有這個能力。了解這一過程與開發(fā)基于NK細胞的治療有關(guān)。 研究還認(rèn)為，在耐受過程之外，抑制性受體不僅對抗激活受體，而且通過自身識別抑制受體的發(fā)展，參與對成熟NK細胞識別自我的“教育”：在NK細胞成熟過程中，NK細胞隨機表達個體抑制性KIR基因，直到有一種不同的抑制受體組合識別出MHC-I信號。人們提出了許多模型來解釋這一過程。 另一種針對癌細胞的方法是通過CD 16受體(FCγRIIIA)在NK細胞上表達?；罨?，NK細胞能有效地識別與癌細胞結(jié)合的IgG抗體的Fc部分，并通過ADCC溶解這些包被抗體的細胞。 NK細胞：激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的橋梁 在細胞毒性反應(yīng)的同時，釋放的細胞因子和趨化因子進一步吸引其他NK細胞、DC和T細胞。腫瘤壞死因子-α等促炎細胞因子通過NK細胞FASL與腫瘤細胞Fas復(fù)合物的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細胞壞死，從而誘導(dǎo)靶細胞凋亡。其他趨化因子(如CCl 3、4、5和10)通過化學(xué)梯度將免疫效應(yīng)細胞定向到腫瘤部位，而其他如IL-10和IL-6則在產(chǎn)生部位增強免疫活性。例如，通過釋放CCL 5、XCL 1和XCL 2，NK細胞促進DC進入實體腫瘤。同樣地，淋巴結(jié)中NK細胞的激活促進了IFN-γ的釋放，通過吸收額外的免疫效應(yīng)細胞，包括抗原提呈細胞(巨噬細胞和樹突狀細胞)，誘導(dǎo)促炎性腫瘤微環(huán)境，最終驅(qū)動TH1免疫反應(yīng)，動員T細胞進入淋巴結(jié)，并從CD8 T細胞分化為細胞毒性T淋巴細胞。最后，NK細胞通過攻擊未成熟的DC和保留成熟的DC，以保證免疫應(yīng)答的質(zhì)量。 與NK細胞相關(guān)的腫瘤免疫逃逸的機制 NK細胞與MHC-I分子之間的關(guān)鍵相互作用是防止自身免疫破壞的重要機制，也是腫瘤細胞逃避免疫系統(tǒng)導(dǎo)致NK細胞失能的關(guān)鍵機制。對不同腫瘤類型的多項研究表明，當(dāng)腫瘤內(nèi)NKG2D激活的NK細胞相對于外周血中的比例較高時，對轉(zhuǎn)移有積極的預(yù)后價值和風(fēng)險預(yù)測。腫瘤細胞逃避NK細胞免疫監(jiān)視的一種方法是將NK細胞與KIR受體結(jié)合后識別為自身的MHCⅠ類分子表達。其他的腫瘤逃逸方式也被描述，包括通過PDPD-L1的相互作用來抑制免疫反應(yīng)，類似于T細胞抑制。NK2GD配體、MICA和MICB從腫瘤細胞表面脫落是腫瘤逃逸的另一個主要機制，同樣，腫瘤細胞通過產(chǎn)生TGF-β和Kynurenine而進化出下調(diào)NK細胞NKG2D表達，也是一種策略。正是由于我們對這些逃逸機制的具體理解，我們才制定了新的、以NK細胞為基礎(chǔ)的治療策略。 腫瘤微環(huán)境和NK細胞抗腫瘤活性 TME在腫瘤細胞逃避NK細胞免疫監(jiān)視中起著重要作用。它被認(rèn)為是一種破壞正常血液供應(yīng)和血管生成的環(huán)境，并通過基質(zhì)、代謝和免疫抑制機制的激活而誘導(dǎo)低氧環(huán)境。這種缺氧破壞了NK細胞的多種功能，為腫瘤的擴張、生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了有利的環(huán)境。微環(huán)境可通過腫瘤源因子、自噬調(diào)節(jié)殺傷、調(diào)節(jié)癌細胞代謝和腫瘤衍生小泡，如腫瘤細胞外顯子和分泌的microRNAs等低氧狀態(tài)下產(chǎn)生的微RNA，導(dǎo)致NK細胞功能受損。 缺氧是產(chǎn)生免疫抑制性TME的關(guān)鍵因素之一，低氧腫瘤細胞通過抑制NKG2D激活受體的表達和產(chǎn)生轉(zhuǎn)化生長因子-β而產(chǎn)生細胞因子，這些細胞因子通過抑制NKG2D激活受體的表達和分泌而產(chǎn)生細胞因子，包括調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的上調(diào)。通過產(chǎn)生HIF1-α，MDSCs分化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞，表現(xiàn)出M2反應(yīng)，并從癌細胞中切割Fas配體，導(dǎo)致NK和CTL功能受損。此外，低氧環(huán)境允許癌細胞培養(yǎng)基質(zhì)細胞，并通過轉(zhuǎn)化生長因子-β或IL-6的產(chǎn)生將其激活為與腫瘤相關(guān)的成纖維細胞。這些細胞因子反過來抑制IL-2誘導(dǎo)的NK細胞活化受體的上調(diào)，從而降低NK細胞的細胞毒性和免疫監(jiān)視。 除了創(chuàng)造一個免疫抑制環(huán)境外，缺氧還會破壞 NK 細胞的功能和細胞毒性。增加 TME 中的乳酸和腺苷。乳酸通過降低細胞外的功能而破壞 NK 細胞的功能pH值和腺苷升高導(dǎo)致抑制 IL-2 刺激的 NK 細胞釋放 TNF - α ，并抑制NK 細胞的增殖和細胞毒性功能。此外，缺氧誘導(dǎo)的一氧化氮 (NO) 信號傳導(dǎo)激活導(dǎo)致 MICA 脫落，這是一種重要的腫瘤逃逸機制，同時也導(dǎo)致 COX-2/PGE2 途徑的解除調(diào)節(jié)。在許多腺瘤和癌細胞中發(fā)現(xiàn) COX-2 過表達缺氧條件和 PGE2 的增加被發(fā)現(xiàn)直接抑制 NK 細胞的細胞毒性作用多激活受體的下調(diào)。此外，氧氣和營養(yǎng)缺乏在窮人灌注環(huán)境導(dǎo)致自噬激活，從而攝取和降解 NK 細胞顆粒酶B釋放。 最后，腫瘤細胞逃避研究的最新進展集中在腫瘤細胞來源的外顯子和分泌的微RNA在TME中的作用[46]。含有轉(zhuǎn)化生長因子-β、MICA或MICB的腫瘤外顯子可降低NK細胞NK2GD激活受體的表達，減弱NK細胞的殺傷能力和增殖[47，48]。微RNA，特別是miR-210，在缺氧條件下被發(fā)現(xiàn)釋放，并能誘導(dǎo)血管生成和腫瘤生長/轉(zhuǎn)移。對microRNAs的更好理解可能被用來開發(fā)新的預(yù)后和/或治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。 免疫抑制 TME 在阻止 NK 細胞激活方面特別重要，如上所述.. 然而，NK 細胞在實體腫瘤中的療效的另一個主要障礙與其腫瘤部位成功歸巢有關(guān)。這一方面，特別是解釋了成功地將體外實驗轉(zhuǎn)化成體內(nèi)環(huán)境。前述趨化因子梯度的解除是阻止 NK 的主要機制細胞歸巢到實體腫瘤部位。例如，已經(jīng)證明異常的 EGFR-RAS 信號可以抑制產(chǎn)生 CCL27 ，阻止白細胞歸巢皮膚腫瘤和加速小鼠腫瘤生長模型 。同樣，通過活性氮對 NK 細胞招募的重要趨化因子 CCL2 進行亞硝基化在 TME 中的物種，降低了它吸收白細胞的能力，而改變的 CXCL 11 蛋白水解損害了結(jié)合并通過趨化因子的信號傳遞，最終減少淋巴細胞的遷移 。另一個挑戰(zhàn)是適當(dāng)?shù)臍w巢和腫瘤浸潤與不良的病理性血管生成有關(guān)，血管生成是一個實質(zhì)性的屏障適當(dāng)?shù)?NK 細胞傳遞和細胞向腫瘤部位的外滲，并介導(dǎo)免疫抑制。 NK細胞和腫瘤干細胞 腫瘤干細胞(CSCs)是腫瘤中能夠通過不對稱細胞分裂自我更新的少數(shù)亞群。這些細胞是腫瘤細胞異質(zhì)性的基礎(chǔ)，這對目前的抗癌治療方式提出了挑戰(zhàn)，主要與實體腫瘤有關(guān)。CSCs對傳統(tǒng)的癌癥治療具有抗藥性，其治療后的持久性可導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)，而其去分化狀態(tài)使其能夠轉(zhuǎn)移和/或重新植入先前的靶向病變。一般來說，CSCs的特點是缺乏一致的表面標(biāo)記。然而，正是由于缺乏/下調(diào)MHC-I的表達，首先引起了關(guān)于NK細胞在針對CSC的潛在用途方面的問題。這一觀點在涉及結(jié)直腸癌和膠質(zhì)母細胞瘤樣本的一些研究中得到證實，在接受化療的患者源性細胞系中檢測到CSCs的富集，隨后NK細胞有效地靶向CSCs。在一組全面而優(yōu)雅的實驗中，Ames等人。證明NK細胞如何優(yōu)先靶向CSCs，利用NK細胞與多種人癌細胞株和分離的原癌標(biāo)本共培養(yǎng)模型(自體和異體)，以及NK在異種移植小鼠模型中的轉(zhuǎn)移：這種優(yōu)先靶向性CSCs是通過NKG2D激活受體的相互作用而產(chǎn)生的。從健康供者(用重組人白細胞介素-2培養(yǎng))分離和擴增的NK細胞與患者來源的腫瘤細胞共同孵育時，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)ALDHDim和ALDHbrightCSCs均有明顯下降，后者表現(xiàn)出更高的敏感性NK 細胞治療。同樣，在皮下異種移植瘤模型中，瘤內(nèi)注射激活的NK細胞后，CSCs(由ALDH和CD24的表達確定)明顯減少，免疫熒光研究顯示腫瘤內(nèi)NK細胞濃度增加。在乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中，靜脈注射體外激活的NK細胞可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性肺腫瘤的腫瘤集落數(shù)量減少，腫瘤集落縮小。最后，靜脈注射NK細胞處理小鼠原位胰腺癌模型，生物發(fā)光顯像顯示治療組與未治療組相比發(fā)光降低，支持NK細胞在體內(nèi)靶向CSCs。流式細胞術(shù)和定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)顯示NKG2D配體和Fas死亡受體在CSCs群體中的表達明顯高于非CSCs，支持NK細胞活化受體配體和死亡受體在靶向CSCs中的作用。有關(guān)CSCs的類似工作也有報道，涉及兒童和青少年/青少年腫瘤，如骨肉瘤。 NK 細胞的另一種非細胞毒性作用最近被描述為“分裂無力”，NK 細胞與 TME 中的單核細胞和巨噬細胞相互作用，導(dǎo)致非能細胞不具有細胞毒性，而是分泌細胞因子，從而促進 CSCs 的分化，使它們對標(biāo)準(zhǔn)更加敏感。 CSCs 對腫瘤增殖、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要性他們對標(biāo)準(zhǔn)細胞毒性治療的耐藥性，靶向 CSCs 已成為腫瘤學(xué)的一個興趣領(lǐng)域，為發(fā)展新的治療方式開辟新的機會。 參考文獻 Lopez-Soto A,. Cancer Cell 32(2), 135–154 (2017). 歲月悠遠含香，人生幾度秋涼 |
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