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分子克隆 最強攻略  注意??！敲重點！！ 小編為你嘔心瀝血整理了超多干貨 以下可能是史上最全、最基礎(chǔ)的 分子克隆知識     分子克隆是一個實驗室最基礎(chǔ)、也是最重要的實驗技術(shù)，照例先介紹原理 !  基本原理 分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。也就是用體外重組的方法將目的基因插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的受體細胞內(nèi)，使目的基因得到復(fù)制與擴增，然后再從篩選后的受體細胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增，并使宿主細胞獲得新的遺傳特征。 還是一臉懵逼？我們可以先了解傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，下面的流程示意圖可以幫助你在腦海中形成一個初步的印象。 傳統(tǒng)分子克隆基本流程  孔子曰：“敏而好學(xué)，不恥下問”。 老實說，上面的好多內(nèi)容我都不懂…… 沒關(guān)系，那我們就從最基礎(chǔ)的各種名詞開始，為大家一一詳解！ 知識小點 PCR 分子克隆的第一步一般為PCR，以獲得大量的可供連入載體的目的基因。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA、引物、4種脫氧核苷酸、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，具體步驟就在此省略。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，有雜帶的需要切膠回收目的片段。 詳情可查看： 您可能會用到： ● 快速從凝膠中回收PCR產(chǎn)物 Wizard? SV Gel and PCR Clean-Up System 插入DNA片段 就是你想要克隆的DNA片段，也被稱為插入片段（Insert）。它可以來自原核細胞或真核細胞，可以是基因組 DNA、另一質(zhì)粒的一部分或線性 DNA 片段、實驗室中人工合成的DNA片段，或者是從mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA。 無論來源類型如何，制備插入DNA片段時常用的第一個步驟是進行限制性內(nèi)切酶酶切，產(chǎn)生匹配的粘性末端，以便接下來將片段插入載體中。 載體 載體（Vector）是能攜帶外源基因（或DNA片段）進入細胞復(fù)制、整合或表達的工具。載體一般是質(zhì)粒，也可以是噬菌體。 可以作為克隆載體的條件: ● 具有對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性，能攜帶外源基因進入宿主細胞； ● 能在宿主細胞中自主復(fù)制，并實現(xiàn)外源基因的增殖； ● 具有由單一限制酶識別的位點組成的多克隆位點(MCS)； ● 具有用于選擇克隆子的標記基因，例如抗生素耐受。如果宿主整合了質(zhì)粒，它將可以在含有抗生素的培養(yǎng)基中存活，這樣允許我們選擇已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化了的細胞。 ● 克隆載體必須是安全的，不能含有對受體細胞有害的基因，并且不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞外的其他生物的細胞，尤其是人的細胞。 您可能會用到： 在此小編額外為大家介紹幾個小小小小的基礎(chǔ)知識點： 限制性酶切位點 Restriction Enzyme cutting site DNA上一段堿基的特定序列，DNA限制性內(nèi)切酶能夠識別出這個序列并在此將DNA序列切成兩段。限制性內(nèi)切酶位點外一般需要有保護堿基。 多克隆位點 Multiple Cloning Site, MCS 是包含多個（最多20個）限制性酶切位點的一段很短的DNA序列。每個限制性酶切位點通常是唯一的，即它們在一個特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。 在一些載體中，MCS 位于標記基因內(nèi)，可篩選已經(jīng)成功拼接進插入DNA片段的克隆子。例如后面會講到的藍白篩選。  宿主細胞 宿主細胞也叫受體細胞，指在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)中接受外源基因的細胞。進行基因工程的宿主細胞一般為限制酶缺陷型，便于后續(xù)的克隆篩選。宿主細胞有原核受體細胞、真核受體細胞(最主要是酵母菌)、動物細胞和昆蟲細胞（其實也是真核細胞）。原核受體細胞中,最常用的宿主細胞是大腸桿菌，它生長迅速，可廣泛獲得不同克隆載體。 一般可根據(jù)插入DNA片段的類型選擇最佳載體及宿主細胞。 以下視頻詳細介紹了質(zhì)粒載體的制備， 還有中英文雙語對照哦~ How to perform plasmid prep  雙酶切 分子克隆中通常將插入DNA片段和載體進行雙酶切，即選擇一種內(nèi)切酶同時切割插入DNA片段和載體 DNA，以生成連接所需的互補末端 ，由于載體和插入DNA片段末端之間的兼容匹配性，二者僅可沿一個方向連接，因而這種方法可實現(xiàn)目的DNA片段的插入。進行雙酶切時，同時提供兩種酶所需最優(yōu)的反應(yīng)緩沖液和反應(yīng)條件至關(guān)重要。因此，為確保酶切成功，應(yīng)嚴格遵守供應(yīng)商提供的雙酶切反應(yīng)建議。 您可能會用到： 連接 連接(Ligation)是插入DNA片段和載體連接成為重組質(zhì)粒的過程，需要DNA連接酶，最常用的就是T4 DNA連接酶，可連接DNA末端的 5′磷酸基和 3′羥基。連接反應(yīng)通常還需要ATP、DTT 和鎂離子等成分，為了提高連接效率可優(yōu)化反應(yīng)條件。 您可能會用到： 點擊鏈接觀看視頻，視頻對連接的步驟進行了非常詳細的介紹哦~ 感受態(tài)細胞 感受態(tài)細胞（Competent cell）：通過理化方法誘導(dǎo)細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。主要原理就是使細胞的通透性變大，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。一般可使用CaCl2法或電轉(zhuǎn)法處理受體細胞制備感受態(tài)細胞，或直接進行購買。 您可能會用到： 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化（Transformation）是受體細胞直接攝取供體細胞的DNA片段而獲得新的遺傳性狀的過程。一般情況下質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化效率很低，因此需要先制備感受態(tài)細胞?？筛鶕?jù)下游應(yīng)用的不同選擇不同的感受態(tài)細胞。一般的轉(zhuǎn)化步驟為將連接體系加到感受態(tài)細胞中冰上孵育，然后42°C下熱激活，再至于冰上。處理后，部分質(zhì)粒DNA會被受體細胞吸收，并在體內(nèi)開始復(fù)制。亦可采用電轉(zhuǎn)化的方法，使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細胞。 具體的轉(zhuǎn)化相關(guān)介紹請點擊以下視頻： How to perform transformation 轉(zhuǎn)化后即可在平板上接種細胞進行培養(yǎng)，點擊下方鏈接觀看視頻查看詳細步驟： 克隆篩選 接下來我們以最常用的藍白篩選為例介紹克隆篩選，由于藍白篩選使用T載體進行，因此不需要做雙酶切。平板上最終產(chǎn)生的藍、白菌落中，白色菌落為我們要的目的菌落。藍白斑篩選是一種分子克隆中常用的克隆篩選方法。 藍白篩選原理 野生型大腸桿菌可以產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，可以將無色的化合物X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和藍色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍色。也就是說在X-gal底物的平板中可以生長且菌落呈藍色的是能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的菌落。 適用于藍白篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主細菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因發(fā)生突變，導(dǎo)致其編碼的β-半乳糖苷酶失去一個α肽段，從而不具有生物活性，及無法產(chǎn)生完整的β-半乳糖苷酶。未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體的受體細胞單獨培養(yǎng)只能產(chǎn)生白色菌落。 您可能會用到： 一般的藍白篩選都會和抗性篩選結(jié)合使用，抗性篩選可確定受體細胞是否吸收質(zhì)粒載體。如選擇帶有抗生素基因標記的載體，不含載體的細菌不帶有抗性基因，無法在含有抗生素的平板上生長；經(jīng)過轉(zhuǎn)化含有載體的細菌（不管是否含有插入DNA片段）都可表達抗生素耐受基因，因而可以在含有抗生素的平板上生長。 您可能會用到： 用于藍白篩選的載體上具有β-半乳糖苷酶啟動子和編碼α肽段的基因，編碼α肽段的基因區(qū)段中包含一個多克隆位點（MCS），但其本身不影響載體編碼的α肽鏈的活性。當該載體被轉(zhuǎn)入宿主細胞中后，載體產(chǎn)生的α肽鏈與宿主細胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶突變體互補，具有完整酶的活性，即可將X-gal底物分解產(chǎn)生藍色物質(zhì)，這種現(xiàn)象叫α互補。也就是說轉(zhuǎn)入細胞的載體的多克隆位點上沒有插入DNA片段時，該菌落呈現(xiàn)藍色。 實驗中通常添加IPTG激活載體中的啟動子，攜帶空載體的細胞呈藍色，插入DNA片段與外源基因連接后，重組質(zhì)粒載體不表達α肽鏈，因此不能分解底物產(chǎn)生藍色物質(zhì)，培養(yǎng)表型呈現(xiàn)白色菌落。但是未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體的細菌，由于不能形成完整的β-半乳糖苷酶，菌落也呈現(xiàn)白色。 藍白篩選步驟 具體了解藍白篩選步驟可點擊上方視頻哦 Blue-White cloning 如果你還沒有閱讀盡興， |
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來自： stingray928 > 《生物》
