經(jīng)好久沒(méi)有寫(xiě)技術(shù)性文章了，有點(diǎn)生疏，措辭不太合適的地方，還望各位大佬們多多包涵~

小編最近迷戀上了外泌體的研究，在此分享一下，也希望能讓大家長(zhǎng)些知識(shí)。

【Endoplasmic Reticulum Stress Promotes Liver Cancer Cells to Release Exosomal miR-23a-3p and Up-regulate PD-L1 Expression in Macrophages

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)肝癌細(xì)胞釋放外泌體miR-23a-3p并上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)】

孫國(guó)平、王華課題組的研究人員在Hepatology雜志發(fā)表文章，發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激下的肝癌細(xì)胞通過(guò)外泌體將特定的miRNA轉(zhuǎn)移到浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞從而影響PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的免疫逃逸。

那么，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激到底是如何影響PD-L1表達(dá)呢？

導(dǎo)語(yǔ)

1. 肝細(xì)胞癌（HCC）是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，在全世界生存率很低。手術(shù)是HCC患者最有效的治療策略，但超過(guò)80％的患者在確診時(shí)已無(wú)法完全通過(guò)手術(shù)切除。因此，迫切需要對(duì)HCC開(kāi)發(fā)更有效的系統(tǒng)治療方式。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下的肝癌細(xì)胞將特定的miRNA通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移到腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的免疫逃逸，為肝癌治療提供了新的有效策略。（什么是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，大家可以看本期第二篇文章）

2. 外泌體被視為特異性分泌的膜泡，參與細(xì)胞間通訊。HCC細(xì)胞來(lái)源的外泌體可轉(zhuǎn)移miR-23a-3p進(jìn)而增加PD-L1的表達(dá)（miR-23a-PTEN-AKT）。T細(xì)胞與Exo-TM（exosomes derived from tunicamycin treated HCC cells）刺激的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)降低了CD8+ T細(xì)胞比率并減少白細(xì)胞介素-2產(chǎn)生，并增加了T細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果表明miRNA是外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊的重要分子。

3. 研究結(jié)果表明，在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸過(guò)程中， miR-23a-3p通過(guò)外泌體（ER應(yīng)激的HCC細(xì)胞）向巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用，該研究結(jié)果為腫瘤細(xì)胞如何逃避抗腫瘤免疫提供了新的見(jiàn)解。

研究思路

文章涉及的技術(shù)方法

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

免疫組化（IHC）

免疫熒光（IF）

免疫印跡（WB）

定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）

高通量測(cè)序（HTS）

液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS / MS）

研究結(jié)果

1. 人類HCC中ER應(yīng)激被激活

免疫組化結(jié)果顯示W(wǎng)B、qPCR結(jié)果表示，ER應(yīng)激相關(guān)的蛋白（GRP78，PERK，ATF6和IRE1α）在HCC組織中均高表達(dá)。（Figure1）

2. ER應(yīng)激的激活與人HCC的不良生存相關(guān)——Kaplan-Meier 曲線表示，過(guò)表達(dá)GRP78、ATF6、PERK和IRE1α的患者的總體存活率明顯短于低表達(dá)水平的患者。（Figure2）

3. ER應(yīng)激與HCC患者的PD-L1表達(dá)有關(guān)

   表達(dá)較高水平的GRP78（GRP78 high）的腫瘤組織在基質(zhì)中具有大量CD68染色，而在表達(dá)低水平GRP78（GRP78 low）的腫瘤組織中CD68 +巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)低得多。定量分析顯示GRP78 high腫瘤基質(zhì)中的CD68 +區(qū)域顯著高于GRP78 low基質(zhì)中的CD68 +區(qū)域，有相關(guān)報(bào)道表示，PD-L1抑制T細(xì)胞活化并導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GRP78 high腫瘤中PD -L1分布水平明顯高于GRP78 low腫瘤。此外，qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與癌旁組織相比，PD-L1 mRNA和蛋白在腫瘤組織中顯著上調(diào)。免疫熒光雙染色，發(fā)現(xiàn)GRP78 high HCC腫瘤基質(zhì)中，PD-L1常與CD68 +巨噬細(xì)胞共定位。Kaplan-Meier分析顯示，低表達(dá)PD-L1的患者存活時(shí)間長(zhǎng)于高表達(dá)PD-L1的患者。（Figure3）

4. 在體外，ER應(yīng)激的HCC細(xì)胞的外泌體上調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)

前面結(jié)果表明高ER應(yīng)激狀態(tài)與HCC患者巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)上調(diào)有關(guān)，提示ER應(yīng)激HCC可能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。外泌體是不同細(xì)胞類型之間的重要通信者，作者假設(shè)ER應(yīng)激的HCC細(xì)胞可以釋放外泌體并隨后上調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。在體外，將巨噬細(xì)胞分別與HepG2衍生的Exo-con（未處理的HCC細(xì)胞外泌體）和Exo-TM（衣霉素處理的HCC細(xì)胞外泌體）共孵育，之后做免疫組化、蛋白質(zhì)印跡和qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，Exo-TM增加巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。（Figure4）

5. 在體內(nèi)，Exo-TM上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)

為了確定Exo-TM是否也能增強(qiáng)體內(nèi)PD-L1的表達(dá)。通過(guò)小鼠尾靜脈靜脈注射PKH67標(biāo)記的外泌體，之后對(duì)組織進(jìn)行PD-L1表達(dá)水平的檢測(cè)（qPCR、免疫組化、蛋白印跡），結(jié)果顯示， Exo-TM在體內(nèi)上調(diào)PD-L1的表達(dá)。（Figure5）

6. Exo-TM處理巨噬細(xì)胞降低了CD8 + T細(xì)胞比率并促進(jìn)T細(xì)胞凋亡

有相關(guān)報(bào)道表明，腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)通過(guò)損害CD8 + T細(xì)胞的免疫應(yīng)答來(lái)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。作者猜想ER應(yīng)激的HCC細(xì)胞是否也是通過(guò)損害CD8 + T細(xì)胞的免疫應(yīng)答來(lái)促進(jìn)HCC進(jìn)展。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Exo-TM處理的巨噬細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，與Exo-con處理的巨噬細(xì)胞相比，Exo-TM處理的巨噬細(xì)胞顯著降低了CD8 + T細(xì)胞比例。此外，使用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)T細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)與Exo-TM處理的巨噬細(xì)胞孵育后凋亡T細(xì)胞的比例顯著高于Exo-con處理的巨噬細(xì)胞。（Figure6）

7. ER應(yīng)激的HCC來(lái)源的外泌體含有高水平的miR-23a-3p，通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/AKT通路上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)

為了確定ER應(yīng)激的肝癌細(xì)胞是否通過(guò)外泌體向巨噬細(xì)胞傳遞特異性miRNA并影響其免疫功能，作者對(duì)外泌體進(jìn)行了高通量測(cè)序分析。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，miR-29a-3p，miR-23a-3p，miR-486-3p和miR-486-5p被預(yù)測(cè)通過(guò)PTEN-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)，qPCR分析結(jié)果顯示miR-23a-3p在Exo-TM中具有最高的倍數(shù)增長(zhǎng)。用microRNA數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PTEN是miR-23a-3p的一個(gè)假定目標(biāo)，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析和蛋白質(zhì)印跡得到證實(shí)。有研究報(bào)道PTEN可調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，用miR-23a-3p mimics處理mTHP-1細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。結(jié)果顯示， miR-23a-3p上調(diào)巨噬細(xì)胞中的PD-L1表達(dá)。（Figure7）

8.  為了進(jìn)一步證實(shí)miR-23a-3p是否通過(guò)激活PTEN / AKT途徑調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)，作者首先將巨噬細(xì)胞與Exo-TM或Exo-con共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與Exo-con相比，Exo- TM顯著下調(diào)PTEN并上調(diào)p-AKT。此外，qPCR分析證明，與Exo-con相比，Exo-TM顯著增加了共孵育的巨噬細(xì)胞中miR-23a-3p的表達(dá)。用miR-23a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞消除了Exo-TM介導(dǎo)的PTEN下調(diào)和p-AKT上調(diào)。之后，作者對(duì)PTEN進(jìn)行敲低，發(fā)現(xiàn)PTEN的敲低顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，Exo-TM通過(guò)抑制PTEN和隨后的AKT途徑激活上調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)。（Figure8）

結(jié)論：結(jié)果表明，HCC細(xì)胞可以通過(guò)外泌體向浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞傳遞ER應(yīng)激信號(hào)miR-23a-3p分子（miR-23a-PTEN-AKT途徑），進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。