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輪枝孢菌(Verticillium Nees)在分類上被劃歸為有性生殖不太明了的半知類真菌,目前被報道的已有40余種,均是土壤中的常見真菌。該屬真菌的種間差異較大,依據(jù)形態(tài)學(xué)指標(biāo)被分為5個型;依其生物學(xué)習(xí)性又可分為3大類,即土源性腐生菌,昆蟲、植物線蟲和蘑菇線蟲的兼性寄生菌,以及嚴(yán)重危害農(nóng)作物的病原菌。目前,菌種的鑒定主要由形態(tài)學(xué)和生長習(xí)性兩個特征綜合確定,但由于其為半知類菌,所以對該屬內(nèi)一些種的確切分類地位仍需完善。厚垣輪枝孢菌為該屬12種噬線蟲的輪枝孢菌之一,根據(jù)其瓶梗分生孢子呈鏈狀或是呈頭狀排列,又可細(xì)分為2個變種,即厚垣輪枝孢串孢變種和厚 垣輪枝孢厚 孢變種。在植物線蟲生物防治上有重要意義的就是厚垣輪枝孢厚孢變種。 一、生物學(xué)習(xí)性 1、生長特點。 厚垣輪枝孢菌是一種兼性寄生菌,既能在土壤中營腐生生活,又能寄生于植物根圍區(qū)的球形胞囊線蟲、胞囊線蟲 和根結(jié)線蟲等固著性較強(qiáng)的植物線蟲的雌蟲、胞囊、卵囊或蟲卵內(nèi)。該菌雖然也可侵染植物的根表皮,但不能進(jìn)一步侵染根內(nèi)部的維管層,所以不會致病于植物。 厚垣輪枝孢菌的營養(yǎng)菌絲呈匍匐狀生長,分隔、分枝、淡白色。氣生菌絲薄,瓶梗常從平臥菌絲上單生或2～3個輪生,頂端產(chǎn)生單細(xì)胞核的分生孢子,易脫落,圓形或橢圓形,微帶色澤。磚格狀多細(xì)胞核的厚垣孢子由氣生菌絲細(xì)胞質(zhì)濃縮、外壁增厚而形成,是一種無休眠性的孢子,這種孢子在營養(yǎng)豐富和正常環(huán)境下都能大量產(chǎn)生。厚垣孢子對高溫、干旱的耐受力比分生孢子和菌絲強(qiáng),更易在土壤中存活,所以生防時主要用這種孢子對土壤接種。 2、分離培養(yǎng)及營養(yǎng)需求 植物根圍土壤中的習(xí)居菌物種類多,所以用常規(guī)培養(yǎng)基分離純化厚垣輪枝孢菌比較困難。一般用含有苯來特、苯丙咪唑或塞菌靈等的半選擇培養(yǎng)基分離純化厚垣輪枝孢菌,這些藥物對厚垣輪枝孢菌不敏感,但對土壤中其他真菌有殺滅作用,作用靶點是菌絲的β-微蛋白管。Crump等報道,厚垣輪枝孢菌可以在麥麩、大麥、小麥桿及粗沙混合組成的原料上生長。Mauchline等將厚垣孢子接種于經(jīng)γ-射線消毒的富含有機(jī)質(zhì)的沙質(zhì)肥土上,結(jié)果表明其能良好生長。cPCR法檢測發(fā)現(xiàn),接種1周后土壤中的菌物生長即可達(dá)到高峰。張虹等對厚垣輪枝菌的實驗室培養(yǎng)條件進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),其在草炭培養(yǎng)基、麥麩培養(yǎng)基、麥粒培養(yǎng)基及玉米培養(yǎng)基中均能良好生長,最適生長溫度為25℃,最適pH值為6。 3、動態(tài)變化 厚垣輪枝孢菌生活史包括菌絲體、單細(xì)胞的分生孢子和多細(xì)胞核的厚垣孢子3個階段,所以跟蹤其施入土壤后的動態(tài)變化比較困難。常規(guī)的平板直接計數(shù)法描述的是生殖芽在平板上的克隆,不能說明這種生殖芽到底是由菌絲片段、單細(xì)胞的分生孢子還是由多細(xì)胞的厚垣孢子所引起。Penny等用半選擇培養(yǎng)基法、菌絲β-微管蛋白基因擴(kuò)增法及單克隆抗體法,分別對厚垣輪枝孢菌在根圍中的動態(tài)變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)3種方法各有長處,其中特異性極強(qiáng)的單克隆抗體法對觀察菌物在植物根圍的定殖及其對線蟲的侵染情況非常有用。Mauchline等采用半選擇培養(yǎng)基平板計數(shù)法與cPCR法,對厚垣輪枝孢菌的生長情況進(jìn)行測定,認(rèn)為cPCR雖然可以從菌物的基因拷貝角度較好的反應(yīng)其生長情況,但cPCR法的不足之處在于已死亡菌物的DNA也可被擴(kuò)增,所以只有2種方法相結(jié)合才能更好地闡明菌物的動態(tài)變化。 二、噬線蟲機(jī)制 1、侵染 厚垣輪枝孢菌的菌絲網(wǎng)依靠一種目前尚不清楚的識別機(jī)制對線蟲雌蟲及蟲卵等進(jìn)行識別。Morgan-Jones等在透射電鏡下,觀察了厚垣輪枝孢菌對花生根結(jié)線蟲卵的侵染過程:首先在卵殼表面侵染點處形成附著器,然后形成很細(xì)的侵染絲進(jìn)入卵殼,一旦入侵,即在卵內(nèi)形成侵染泡。Chen等觀察了厚垣輪枝孢菌侵染大豆胞囊線蟲的情況,當(dāng)胞囊表面的菌絲開始侵染時,侵染停留在侵染點或隨菌絲進(jìn)入胞囊,從而在胞囊殼上留下許多小孔,胞囊內(nèi)的侵染釘直徑一般小于1μm,比正常的營養(yǎng)菌絲細(xì)得多。 2、消解 當(dāng)厚垣輪枝孢菌侵入雌蟲和蟲卵后,就開始消解并吸收其中的營養(yǎng)物質(zhì),這一過程涉及到2類重要的酶,即蛋白酶和幾丁質(zhì)酶。一些學(xué)者對厚垣輪枝孢菌分泌的蛋白酶進(jìn)行了純化和定性分析,發(fā)現(xiàn)這些酶均屬于枯草桿菌蛋白酶類,并具有很高的同源性,其中1種蛋白酶VCP1分子質(zhì)量為33000 u,等電點為10.2,可以水解凝乳蛋白酶基質(zhì)、彈性蛋白、酪蛋白等。Sergrs等用原位雜交法觀察到純化的VCP1可水解南方根結(jié)線蟲蟲卵的外層殼膜,直至蟲卵殼的幾丁質(zhì)層暴露。Dackman等較早檢測到了厚垣輪枝孢菌可分泌幾丁質(zhì)酶,并且發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶活水平與其對甜菜胞囊線蟲的致病 性成正相關(guān)。Tikhonov等將厚垣輪枝孢菌培養(yǎng)于膠質(zhì)狀的角質(zhì)素上,培養(yǎng)18～20d后再進(jìn)行過濾,收集濾液并進(jìn)行幾丁質(zhì)酶的提取和純化,測定其分子質(zhì)量為43000u,最適pH值是5.2～5.3;并用掃描電鏡觀察了該酶對馬鈴薯白色球形胞囊線蟲卵的作用情況。 三、生物防治的應(yīng)用 1、自然控制 自然控制指通過土壤中本身存在的拮抗微生物來抑制線蟲的數(shù)量,主要表現(xiàn)為自然環(huán)境下土壤中的植物線蟲數(shù)量及其危害情況逐漸下降的現(xiàn)象。Kerry等跟蹤調(diào)查了同一地塊單作禾谷類作物時,發(fā)現(xiàn)在前2年,土壤中燕麥胞囊線蟲的群體數(shù)量增長到高峰而造成減產(chǎn),隨后線蟲數(shù)量迅速下降,研究證實這主要是由于厚垣輪枝孢菌對燕麥胞囊線蟲卵及雌蟲的寄生所致。Stirling等在澳大利亞調(diào)查發(fā)現(xiàn),燕麥胞囊線蟲在土壤中的天敵也是厚垣輪枝孢菌。自然控制雖然可起到抑制線蟲數(shù)量的作用,但形成這種拮抗反應(yīng)比較慢。不過這種生防系統(tǒng)一旦建立,便可較長時間地將線蟲對作物的危害控制在經(jīng)濟(jì)閾值以下。 2、引入控制 引入控制指人為地將噬線蟲的生防劑施入土壤直接防治線蟲。據(jù)報道,引入厚垣輪枝孢菌控制根結(jié)線蟲的試驗效果都較好。Leij等將厚垣輪枝菌引入田間土壤,土壤中的根結(jié)線蟲數(shù)量可減少90%。楊樹軍等研究了厚垣輪枝孢LZ1菌株對危害云 南煙草的南方根結(jié)線蟲的卵囊和分 散化卵囊孵化的影響,結(jié)果表明該菌對分散卵的相對抑制率達(dá)27.15% ,而對卵囊的相對抑制率常可高達(dá)67.53%。林茂松等用分離到的1株噬線蟲能力強(qiáng)的厚垣輪枝孢菌,于溫室盆缽內(nèi)進(jìn)行防治南方根結(jié)線蟲的試驗,發(fā)現(xiàn)接種病土重量0.1%的菌劑量,即可明顯降低番茄根上的線蟲群體數(shù)量和根結(jié)指數(shù),卵寄生率達(dá)53.7%;接種病土重量1%的菌劑量,番茄植株地上部鮮重平均比對照組重3.3g,每克根長比對照組增長近1倍。 四、影響生物防治的因素 1、土壤環(huán)境 噬線蟲真菌的豐富度與土壤含沙量、有機(jī)質(zhì)含量、重金屬含量及土壤pH值有關(guān),在沙性、有機(jī)質(zhì)含量高以及偏酸性土壤中,噬線蟲真菌較豐富;土壤濕度對噬線蟲真菌活性也有影響,土壤濕度過高或過低都影響真菌對線蟲的侵染。在試驗情況下,銅、鎂離子對厚垣輪枝孢菌生長均有一定程度的抑制作用,并且這種抑制作用隨離子濃度的增加而增強(qiáng)。此外,植物根圍土壤中的其他微生物群落對噬線蟲真菌的生防效果也有重要影響。Bok-A-Bin分析了蕃茄和土豆根圍中的根結(jié)線蟲卵囊表面的微小生物群落的組成情況,發(fā)現(xiàn)卵囊表面的細(xì)菌和真菌組成極其豐富,其中有20種細(xì)菌尚不能在生物數(shù)據(jù)庫中查到;其進(jìn)一步測定這些細(xì)菌和真菌對厚垣輪枝孢菌生長的拮抗性,發(fā)現(xiàn)23%的細(xì)菌和74%的真菌表現(xiàn)出拮抗性,其中假單胞菌的拮抗性最強(qiáng)。 2、寄主植物 在植物線蟲的生防中,厚垣輪枝孢菌在不同植物根圍的定值優(yōu)勢差別較大,影響著生防效能。比如蕃茄和甘藍(lán)的根圍比土豆的根圍更有利于厚垣輪枝孢菌的定殖。此外,植物如果對線蟲特別敏感,線蟲寄生引起的蟲癭過大,這將使得大量的卵塊被埋藏于根內(nèi)而很難受到菌物的攻擊,此時菌物的防效就會受到影響。這種現(xiàn)象在蕃茄受北方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲寄生時表現(xiàn)得尤為明顯。 3、菌物本身的差異 Mauchline等用根結(jié)線蟲(RKN)和土豆胞囊線蟲(PCN)分別感染蕃茄,然后用1株從PCN處分離到的厚垣輪枝孢菌對其進(jìn)行生物防治,并用cPCR對上述蕃茄根圍中的厚垣輪枝孢菌物進(jìn)行定量測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染PCN的蕃茄根圍土壤中,厚垣輪枝孢菌比感染RKN的蕃茄根圍中的菌物數(shù)量多。這說明從被侵染線蟲(卵)中分離出來的厚垣輪枝孢菌對該線蟲的生防效更好,有一定的宿主特異性。林茂松等從山東、江蘇的大豆胞囊線蟲和南方根結(jié)線蟲卵中,篩選分離厚垣輪枝孢菌,發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株其卵寄生率差異很大。 五、展望 1、生態(tài)學(xué)研究 線蟲生物防治的研究歷史表明,生防菌往往對試驗情況下特定作物的目標(biāo)線蟲防治效果較理想,而在田間效果則不穩(wěn)定。這主要與田間的生態(tài)環(huán)境有關(guān),因此需進(jìn)一步從生態(tài)學(xué)的角度來研究噬線蟲菌物施入田間后的情況。例如植物、線蟲和厚垣輪枝孢菌之間的復(fù)雜營養(yǎng)關(guān)系;菌劑與土壤中其他微生物的拮抗性,土壤的酸堿度、溫濕度及養(yǎng)分等理化因子對生防菌的影響;生防菌被用于土壤后的生長、繁殖、存活、擴(kuò)散能力等。隨著這些問題的不斷解決,將進(jìn)一步提高生防菌對線蟲的防治效果。 2、劑型研究 生防菌在商業(yè)生產(chǎn)上常用于進(jìn)行液體培養(yǎng),以大量生產(chǎn)孢子和菌絲。但顆粒型的生防菌劑最便于田間土壤施用,所以有學(xué)者建議將菌物裝入藻酸鈉之類的膠凝劑后制成固體劑型使用。Jones等研究證實,硅藻鹽、糖蜜、褐煤及粘土等混合做成的小料培養(yǎng)基,很適合厚垣輪枝孢菌的生長;Kerry也在顆粒狀的藻酸鹽與麥麩混合培養(yǎng)物上培養(yǎng)厚垣輪枝孢菌,發(fā)現(xiàn)大約可以長出長達(dá)1cm的菌絲。這表明對顆粒型生防劑的研制是可行的,也是今后的努力方向。 3、菌株的選育 從自然衰退的土壤中,或根據(jù)當(dāng)?shù)刂参锓N類,有選擇地從野生型菌株中篩選出噬線蟲能力強(qiáng)的生防菌,這一直是各地學(xué)者普遍使用的方法。如英國洛桑試驗站一直致力于厚垣輪枝孢菌株防治根結(jié)線蟲的研究,已篩選出VC10等防效較好的菌株。此外,利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行菌株的選育也是很有前景的。當(dāng)找到了生防菌編碼線蟲體壁降解酶的基因或與殺線蟲毒素相關(guān)聯(lián)的基因,就可以將其作為探針去篩選其他噬線蟲能力更強(qiáng)的菌株。利用遺傳工程也完全有可能改變體壁降解酶的結(jié)構(gòu),使其更具有降解活性、專化性和穩(wěn)定性,最終可將編碼這種酶 的基因轉(zhuǎn)入到其他生物中來防制植物線蟲。 4、綜合防治 措施每種生防菌都有一定的使用限制,即只能侵噬某類線蟲或線蟲的某個生活階段,所以可以根據(jù)實際情況,在生產(chǎn)上采用數(shù)種生防菌劑聯(lián)合應(yīng)用。還可以借用其他抗線蟲方法,比如說翻曬土壤,培育抗線蟲作物 ,甚至可以與低劑量、易分解、對生防菌生長影響小的殺線蟲藥物一起使用來控制植物線蟲。此外,還應(yīng)向土壤中多施有機(jī)肥,提高土壤肥力,以利于生防菌和植物的生長,特別是向土壤中添加幾丁質(zhì)可以刺激厚垣輪枝孢菌的活性,提高其對線蟲的寄生率。 參考文獻(xiàn) [1]Thomason IJ.Challenges facing nematology:environmental risks with nematicides and the need for new approaches[A].Veech J A, Dick-son D W.Vistas on nematology [C].Hyattsville,USA: Society of Nematologists,1987.469-476. 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