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基因編輯 基因編輯，即通過(guò)對(duì)基因定點(diǎn)修飾以改變它的功能，并隨之改變細(xì)胞乃至生物體的表型的一種生物學(xué)技術(shù)。無(wú)數(shù)科學(xué)家和不斷改進(jìn)的基因組編輯工具，一方面是更好地理解生命活動(dòng)的規(guī)律和現(xiàn)象，另一方面可為靶向性改造生物提供更有效的手段，如基因治療和遺傳育種。 基因編輯的最早形式是基于同源重組的基因靶向技術(shù)，這只適用于一小部分模型系統(tǒng)，如小鼠和酵母。然而該技術(shù)的基因修飾效率低，實(shí)驗(yàn)過(guò)程緩慢冗長(zhǎng)。 真正推動(dòng)基因組編輯技術(shù)向前發(fā)展的是通過(guò)生物體自身特異性識(shí)別DNA序列的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，加入人工再設(shè)計(jì)的思路，使之能夠特異性地識(shí)別靶標(biāo)序列，特異性定點(diǎn)切割DNA雙鏈，大大提高同源重組和非同源末端連接的頻率。這一發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了一系列基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，使在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯成為可能。 （點(diǎn)擊查看大圖） 在基因編輯技術(shù)的建立和優(yōu)化過(guò)程中需要解決的技術(shù)問(wèn)題包括gRNA效率的驗(yàn)證、快速而靈敏地檢出稀有編輯事件以及優(yōu)化HDR:NHEJ效率。這都需要有快速簡(jiǎn)便的基因編輯效率的評(píng)價(jià)工具。 或許您聽(tīng)過(guò)T7E1核酸酶/Surveyor分析法：通過(guò) PCR擴(kuò)增野生型和基因編輯后的基因組 DNA，擴(kuò)增出含突變的PCR片段，將野生型和突變型PCR 產(chǎn)物進(jìn)行變性退火雜交，再用T7E1核酸酶切割雜交后的 PCR 產(chǎn)物，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，則可快速檢測(cè)出DNA雙鏈?zhǔn)欠癜l(fā)生了突變。然而，這類方法是僅半定量，靈敏度有限，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性/假陰性，且如果存在序列多態(tài)性時(shí)容易受高背景信號(hào)影響。 或許您還聽(tīng)過(guò)PCR-RFLP法：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，通過(guò)PCR擴(kuò)增出基因編輯后的基因組DNA，獲得突變位點(diǎn)的PCR片段，然后根據(jù)突變位點(diǎn)附近特異的限制性內(nèi)切酶切割PCR片段，通過(guò)瓊脂糖電泳分型來(lái)檢測(cè)是否發(fā)生了突變。這種方法檢測(cè)成本較低，但受限于DNA序列上的酶切位點(diǎn)，若突變后酶切位點(diǎn)未破壞，則會(huì)漏檢突變體。 HRM，高分辨率熔解曲線分析技術(shù)，基于單核苷酸熔解溫度差異而形成不同形態(tài)的熔解曲線的原理進(jìn)行分析，其在PCR基礎(chǔ)上通過(guò)測(cè)定DNA雙鏈熔解曲線來(lái)檢測(cè)突變，熔解曲線取決于 DNA序列、長(zhǎng)度和 GC含量等， 可以檢測(cè)樣品突變 、單核苷酸多態(tài)性和甲基化。該方法檢測(cè)靈敏度和特異性都較高，但細(xì)胞中存在的天然SNP位點(diǎn)會(huì)干擾對(duì)基因編輯位點(diǎn)的判定。 對(duì)于基因編輯效率的檢測(cè)，Bio-Rad可提供從細(xì)胞、核酸、蛋白三大層面的整體解決方案： Bio-Rad快速、準(zhǔn)確檢測(cè)基因編輯效率的方法是直接裂解，再利用結(jié)合微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)步驟： 1. 采用CRISPR/Cas9方法將細(xì)胞進(jìn)行NHEJ基因編輯 2. 將經(jīng)基因編輯的細(xì)胞分成兩部分，一部分采用柱純化法提取gDNA，另一部分直接采用Bio-Rad SingleShot Cell Lysis Buffer（# 1725080/ #1725081）進(jìn)行細(xì)胞裂解 3. 同時(shí)利用ddPCR技術(shù)進(jìn)行基因編輯效率檢測(cè)，最后對(duì)比分析步驟2兩種處理方法的結(jié)果一致性 （點(diǎn)擊查看大圖） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1. ddPCR微滴分簇2-D圖。A：SingleShot直接裂解 ; B：柱純化提取gDNA，對(duì)比可知分簇效果一致，直接裂解法不影響ddPCR實(shí)驗(yàn)。 （點(diǎn)擊查看大圖） 注：ddPCR檢測(cè)NHEJ基因編輯效率時(shí)，采用Drop-Off引物探針設(shè)計(jì)原理，見(jiàn)下圖。野生型模板可檢測(cè)出兩種熒光信號(hào)；突變型模板僅可檢出一種熒光信號(hào)。 （點(diǎn)擊查看大圖） 2. NHEJ基因編輯事件/效率絕對(duì)定量。A：編輯效率百分比；B：微滴數(shù)，對(duì)比可知兩種處理方法均無(wú)顯著差異。 （點(diǎn)擊查看大圖） 綜上所述，SingleShot細(xì)胞裂解Buffer結(jié)合ddPCR基因組編輯效率檢測(cè)，可為客戶提供一個(gè)精簡(jiǎn)的工作流程。該流程繞過(guò)了單細(xì)胞有限稀釋和柱純化gDNA提取的需求。整個(gè)過(guò)程可以在轉(zhuǎn)染結(jié)束后立即進(jìn)行，并在<4小時(shí)的時(shí)間內(nèi)、用<1小時(shí)的手動(dòng)操作時(shí)間，對(duì)基因組編輯事件進(jìn)行絕對(duì)定量，結(jié)果可靠，準(zhǔn)確。 注：上述數(shù)據(jù)源于Bulletin 7155, Bulletin 6947, Bulletin 7065 本產(chǎn)品僅限科研使用，不作為臨床診斷。 Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定區(qū)域的商標(biāo)。 這是一個(gè)廣告 |
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