一篇多芯片生信分析（meta）

頭頭了不起 2019-08-04

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摘要

背景：

以往的研究表明，miR-144-3p可能是非小細胞肺癌（NSCLC）的潛在生物標志物。然而，miR-144-3p對NSCLC起源，分化和凋亡的影響以及miR-144-3p與臨床參數(shù)之間關(guān)系的綜合機制很少有報道。

方法：

我們通過Gene Omnibus（GEO），相關(guān)文獻，癌癥基因組圖譜（TCGA）和RT-qPCR收集的數(shù)據(jù)，研究了miR-144-3p表達與臨床特征之間的相關(guān)性。 RT-qPCR分析以確定miR-144-3p在NSCLC中的臨床作用。此外，我們通過Gene Ontology（GO），Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析研究了miR-144-3p的生物學功能。建立蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)以識別核心基因。

結(jié)果：

meta分析顯示，miR-144-3p聯(lián)合SMD為-0.95，95％CI為（-1.37，-0.52），表明miR-144-3p在NSCLC組織中表達較少（相比正常組織）。 MiR-144-3p表達與分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯顯著相關(guān)（P <0.05）。通過生物信息學分析，識別37個基因作為NSCLC中miR-144-3p的靶基因。這些靶基因在各種關(guān)鍵途徑中高度富集，例如蛋白質(zhì)消化和吸收以及甲狀腺激素信號傳導途徑。此外，PPI揭示了五個基因-C12orf5，CEP55，E2F8，STIL和TOP2A-作為中樞基因，閾值為6.

結(jié)論：

目前的研究證實miR-144-3p在NSCLC中低表達。更重要的是，miR-144-3p可能作為NSCLC預(yù)后預(yù)測中的潛在腫瘤生物標志物。生物信息學分析的結(jié)果可能為研究NSCLC的發(fā)病機制提供一種新方法。

介紹

肺癌（LC）被認為是危及生命的疾病，因為發(fā)病率和死亡率在全球所有腫瘤中排名第二。占所有診斷LC病例的85％，非小細胞肺癌（NSCLC）主要分為肺鱗狀細胞癌（LUSC），肺腺癌（LUAD）和大細胞癌（LCC）。目前，NSCLC的主要療法是手術(shù)和化療相結(jié)合。雖然NSCLC的早期檢測，診斷和靶向治療取得了很大進展，但五年生存率仍然很低，根據(jù)區(qū)域差異和疾病分期從4％到17％不等?；加心[瘤和合并癥負擔的患者由于未接受有效或特異性治療而死亡的風險較高。因此，了解NSCLC中的分子機制和鑒定新的治療靶點至關(guān)重要。

miRNA是大約的單鏈ncRNA長度為20個核苷酸。它們通過轉(zhuǎn)錄后與靶基因的mRNA結(jié)合在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用。參與細胞分化和體內(nèi)平衡，miRNA在癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。組織特異性miRNA在癌癥的診斷，治療和預(yù)后中起著新的潛在生物標志物的作用。最近，miRNA對腫瘤發(fā)生和腫瘤進展的影響受到了極大的關(guān)注

MicroRNA-144-3p（miR-144-3p），具有多種功能不同類型癌癥中的癌癥是與癌癥相關(guān)的miRNA之一。 MiR-144-3p可作為喉鱗狀細胞癌，胃癌，肝細胞癌和胰腺癌的抑制因子。然而，它是腎癌，鼻咽癌和結(jié)直腸癌的致癌基因。以前的研究還表明，miR-144-3p通過靶向LC中的TP53誘導型糖酵解和細胞凋亡調(diào)節(jié)因子（TIGAR）參與細胞增殖，凋亡和自噬。 miR-144-3p的下調(diào)通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）導致LC細胞的代謝改變。以前的研究表明，miR-144-3p可能是一種生物標志物，具有巨大的潛力。盡管如此，miR-144-3p對NSCLC起源，分化和凋亡的影響以及miR-144-3p與臨床參數(shù)之間關(guān)系的綜合機制卻鮮有報道。

本研究調(diào)查了兩者之間的相關(guān)性通過從Gene Omnibus（GEO）微陣列，相關(guān)文獻，癌癥基因組圖譜（TCGA）和實時定量實時PCR（RT-qPCR）分析收集的數(shù)據(jù)收集miR-144-3p表達和臨床特征確定臨床作用miR-144-3p在NSCLC中。隨后通過使用12個預(yù)測程序來預(yù)測miR-144-3p靶向的基因來檢查NSCLC中的潛在作用機制。此外，還進行了生物信息學分析，包括基因本體論（GO），京都基因和遺傳基因百科全書（KEGG）以及蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析。

材料與方法

數(shù)據(jù)收集

在GEO數(shù)據(jù)庫中對NSCLC中的miR-144-3p進行搜索（http://www.ncbi.nlm./geo/）：(MicroRNA OR “Micro RNA” OR “non-coding RNA” OR ncRNA OR “small RNA” OR miRNA) AND (Lung OR pulmonary) AND (cancer OR tumor OR neoplasm OR malignancy OR carcinoma OR adenocarcinoma OR AC OR SCC OR NSCLC). 設(shè)置類型為“series”，物種為‘人類’。包含的標準如下：（1）被診斷患有NSCLC及其亞型的患者; （2）包含癌癥和非癌樣品; （3）癌癥和非癌樣品至少三個以; （4）可獲得miR-144-3p的數(shù)據(jù)。從PubMed，谷歌學術(shù)，中國國家知識基礎(chǔ)設(shè)施（CNKI），重慶VIP電子（VIP）和中國萬方數(shù)據(jù)庫中檢索到相關(guān)研究。Fig 1顯示了該研究的工作流程。

mir-144-3p在TCGA的表達

下載來自癌癥基因組圖譜TCGA（https://cancergenome./）的MicroRNA-144-3p表達數(shù)據(jù)用于獲得關(guān)于miR-144-3p在NSCLC和非癌樣品中的表達值的詳細信息。使用IBM SPSS Statistics V22.0軟件計算NSCLC樣品和正常對照中miR-144-3p表達的差異。

Quantitative real-time PCR

對于本研究，125對樣本由廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科提供。樣本進行福爾馬林固定和石蠟包埋（FFPE）以保存。研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準。接下來，通過RT-qPCR用Applied Biosystems 7900HT快速實時PCR系統(tǒng)軟件檢測125對配對臨床樣品中的miR-144-3p表達。 miR-144-3p序列如下：UACAGUAUA GAUGAUGUACU。 2-Δcq的公式用于計算miR-144-3p表達值。

統(tǒng)計分析和meta分析

在miR-144-3p進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后，使用表達譜分析信息用IBM SPSS Statistics V22.0軟件計算每個對照和實驗組的數(shù)量，平均值（M）和標準偏差（SD）。此外，Stata 12.0軟件用于對來自多個來源（芯片，文獻，miRNA測序和RT-qPCR）的數(shù)據(jù)進行全面的meta分析。在森林圖上顯示了NSCLC和無腫瘤標本中miR-144-3p表達的分析，其顯示了標準化平均差異（SMD）和95％保密間隔（CI）。計算Q和I2統(tǒng)計量的卡方檢驗以評估研究中的異質(zhì)性，并確定將隨機效應(yīng)模型或固定效應(yīng)模型應(yīng)用于合并過程的適當性。為了測量出版物偏倚，進行了Egger's和Begg's檢驗以及漏斗圖，其顯著性為p <0.05。

非小細胞肺癌中microRNA-144-3p的潛在靶基因

MiRWALK2.0是miRNA-target相互作用數(shù)據(jù)的在線檔案，用于預(yù)測miR-144-3p靶基因。其使用具有miRWalk，miRMap，MicroT4，miRNAMap，TargetScan PICTAR2，miRBridge，PITA，miRanda，RNAhybrid，miRDB，RNA22的12個數(shù)據(jù)庫。只有超過六個數(shù)據(jù)庫認可的靶基因才被認為是靶基因。 LUAD和LUSC中的高表達基因是通過基因表達譜分析互動分析（GEPIA）獲得。 LUAD和LUSC中上調(diào)基因中的重疊基因和預(yù)測的靶基因被視為NSCLC中miR-144-3p的靶基因。對NSCLC中miR-144-3p特異性靶基因的文獻進行了綜述。通過先前研究確定的靶基因和預(yù)測的靶基因，即有希望的靶基因，用??于功能分析。

靶基因的功能分析

GO，包括生物過程（BP），細胞成分（CCs）和分子功能（MFs），由Metascape（http:///gp/）分析。然后使用Metascape工具通過KEGG途徑分析闡明潛在靶基因的功能注釋。此外，還建立了一個PPI網(wǎng)絡(luò)，以揭示STRING上潛在靶基因的中樞基因，STRING是一個多基因整合功能的門戶網(wǎng)站。

TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的hub基因的表達

來自TCGA和GTEx的hub基因的表達為了進一步證實hub基因在NSCLC中的功能及其與miR-144-3p的關(guān)系，搜索TCGA和基因型組織表達（GTEx）數(shù)據(jù)庫進行以確定NSCLC中hub基因的表達模式。通過GEPIA分析了NSCLC和非癌樣品中的hub基因。

結(jié)果

確認microRNA-144-3p在非小細胞肺癌中的表達和臨床價值，

MicroRNA-144-3p在非小細胞肺癌中的表達通過GEO獲得

來自GEO數(shù)據(jù)庫的19個geo數(shù)據(jù)集符合納入標準。納入的GEO數(shù)據(jù)集特征展示在Tbale1中。其中，14個數(shù)據(jù)集來源于從組織，5個來自血液（GSE27486，GSE40738，GSE64951，GSE93300和GSE114711）。此外，在GEO數(shù)據(jù)庫的下載NSCLC和對照組的表達數(shù)據(jù)。對于來自組織樣本的數(shù)據(jù)集，NSCLC組的miR-144-3p表達水平顯著低于GSE25508，GSE48414，GSE51853，GSE56036，GSE63805，GSE72526，GSE74190和GSE102286中的對照組（p = 0.0202， p <0.0001，p <0.0001，p = 0.0011，p <0.0001，p = 0.0102，p <0.0001，p <0.0001（圖2））。相反，在數(shù)據(jù)集中（GSE14936，GSE29248，GSE36681，GSE47525，GSE53882和GSE77380）之間未檢測到miR-144-3p表達在NSCLC和對照組存在顯著區(qū)別。關(guān)于來自血液樣品的數(shù)據(jù)集中，發(fā)現(xiàn)了NSCLC中miR-144-3p的表達在GSE27486和GSE40738數(shù)據(jù)集中顯著降低（分別為p = 0.0196，p = 0.0036（圖3））。

GEO的meta分析結(jié)果

基于來自GEO數(shù)據(jù)庫的19個微陣列進行了薈萃分析。結(jié)果如圖4a所示。由于存在顯著的異質(zhì)性（p <0.05，I2=94.3％），因此使用隨機效應(yīng)模型，得到miR-144-3p在NSCLC組中顯著下調(diào)（SMD = - 0.89; 95％CI - 1.34， - 0.44; p = 0.000）。隨后進行敏感性分析，以探究是否存在某個數(shù)據(jù)集在顯著異質(zhì)性中發(fā)揮重要作用（圖4b）。在每次薈萃分析中移除單個數(shù)據(jù)集，并與移除之前的效果進行比較。沒有發(fā)現(xiàn)任何單個研究在所有研究中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

生成漏斗圖以估計偏倚（圖4c）。為了進一步闡明異質(zhì)性來源，進行了亞組分析。它基于多種特征：樣品來源（組織與血液）和癌癥類型（腺癌與鱗狀細胞癌）。如圖5所示，在組織亞組中觀察到顯著的異質(zhì)性（I2 = 95.8％，p = 0.000）。在腺癌中也發(fā)現(xiàn)了顯著的異質(zhì)性（I2 = 92.9％，p = 0.000）和鱗狀細胞癌細胞癌（I2 = 95.3％，p = 0.000）。這些結(jié)果表明，樣本來源和癌癥類型可能是異質(zhì)性的來源。

基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)確認microRNA-144-3p在非小細胞肺癌中的表達和臨床效果

MicroRNA-144-3p在非小細胞肺癌組織中的表達和預(yù)后價值

TCGA包含376個LUSC患者樣本和488個LUAD患者樣本。關(guān)于LUSC，與正常對照相比，miR-144-3p表達顯著下調(diào)（2.8193±1.40600對比5.5678±1.27693，p <0.001（圖6a和表2））。就LUAD而言，miR-144-3p的表達水平明顯低于健康組織（2.8959±1.35967對比5.2775±1.64708，p <0.001（圖6，表3））。來自LUSC和LUAD的數(shù)據(jù)進一步合并檢查NSCLC中miR-144-3p的表達。如圖6c和表4所示，miR-144-3p顯著降低NSCLC組織與非癌肺組織相比（2.8632±1.37928對比5.4243±1.4702，p <0.0001）。后來使用Kaplan-Meier曲線來鑒定miR-144-3p的表達對存活時間的影響。如圖所示。如圖7所示，三條Kaplan-Meier曲線的p值均大于0.05，因此表明miR-144-3p水平較低的組與高水平組之間的存活時間無顯著差異。

基于癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)，microRNA-144-3p與非小細胞肺癌臨床病理學的關(guān)系

從表2和表3中可以看出，從TCGA下載了332名LUSC患者和445名LUAD患者的臨床特征。關(guān)于LUSC，在階段（p = 0.040）和原發(fā)腫瘤（T）（p = 0.035）中發(fā)現(xiàn)miR-144-3p的顯著差異。階段III-IV（2.4469±1.41079）的LUSC患者miR-144-3p的表達低于階段I-II（2.8878±1.39556）。 T3-T4中LUSC的miR-144-3p表達（2.5088±1.36178）比T1-T2（2.9023±1.40854）更顯著地降低。就LUAD而言，觀察到miR-144-3p表達的顯著差異（p = 0.031）。階段III-IV（3.1868±1.45395）的患者具有更高的miR-144-3p表達值。基于TCGA的LUAD和LUSC數(shù)據(jù)匯總用于進一步驗證。如表4所示，T階段統(tǒng)計學中的顯著性基于T3-T4患者中較低的miR-144-3p表達（p <0.05）。

定量實時PCR分析microRNA-144-3p表達及其在非小細胞肺癌預(yù)后中的意義

使用RT-qPCR，評估m(xù)iR-144-3p在125個匹配組織中的臨床表達值。如圖8a和表5中所示，NSCLC樣品顯示miR-144-3p的表達水平顯著低于非癌樣品（2.808±1.303對比4.813±2.618，p <0.001）。然后，分析miR-144-3p表達的LUAD和LUSC。如圖8b和c所示，與在相鄰的非癌組織中發(fā)現(xiàn)的不同，在LUSC和LUAD中觀察到明顯低表達的miR-144-3p（p = 0.0004，p <0.0001）。 Kaplan-Meier曲線以評估m(xù)iR-144-3p在LUAD的預(yù)后。如圖9所示，表現(xiàn)出較低miR-144-3p表達值的LUAD患者可能有較差的預(yù)后（p = 0.397）。

microRNA-144-3p表達與非小細胞肺癌患者臨床特征的相關(guān)性

NSCLC患者miR-144-3p表達在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管侵犯方面存在顯著差異（表5）。 miR-144-3p的較低值見于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，但未發(fā)現(xiàn)無沒有它（表5）。血管侵犯患者的miR-144-3p值為2.1400±1.2263，無血管侵犯患者的表達水平為3.0682±1.24395（表5）。為了進一步驗證miR-144-3p的相關(guān)性和臨床病理特征，將NSCLC病例分為LUSC和LUAD組。對于LUSC組（表6），吸煙，血管侵犯或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有統(tǒng)計學差異。然而，對于LUAD，統(tǒng)計分析表明吸煙，血管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的顯著差異。與沒有血管侵犯的患者相比，血管侵犯患者的miR-144-3p表達值較低。吸煙習慣患者的miR-144-3p表達顯著低于沒有這種習慣的患者（p = 0.027，表7）。此外，被認為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者的miR-144-3p表達明顯減少。

基因表達綜合，癌癥基因組圖譜和定量實時PCR數(shù)據(jù)組合的Meta分析

由于未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究，來自三個來源（微陣列，miRNA測序和RT-qPCR）的數(shù)據(jù)包含2264個NSCLC樣本和 968非腫瘤樣本使用隨機效應(yīng)模型的整合薈萃分析，因為它們之間有顯著的高異質(zhì)性（I2 = 95.4％，p = 0.000）。樣本個體，NSCLC亞型和樣本來源的差異被認為是異質(zhì)性的來源。如圖10a所示，miR-144-3p的組合SMD為-0.95，95％CI為（-1.37，-0.52），表明在NSCLC組織中表達的miR-144-3p低于正常對照組織。敏感性分析（圖10b）表明研究之間存在顯著差異; 然而，沒有具體的某個研究對高度異質(zhì)性有顯著影響。使用Begg's和Egger的測試和漏斗圖（圖10c）進行發(fā)表偏倚的評估。通常，漏斗圖是對稱的，并且從Begg和Egger的測試中獲得的p值分別為0.833和0.335。總之，結(jié)果表明研究的發(fā)表偏倚是可控的

生物信息學分析

有希望的靶基因收集

從miRWALK2.0數(shù)據(jù)庫中篩選至少超過6種算法預(yù)測的miR-144-3p靶基因，合計1635個基因。在GEPIA中收集了總共1109個LUAD中過表達的基因，LUSC中共有1922個過表達的基因。交叉后，選擇了34個預(yù)測的靶基因。 miR-144-3p的四個特異性靶點在之前的相關(guān)研究中得到驗證（表8）。 TIGAR也稱為C12orf5基因。因此，收集了總共37個潛在的靶基因。

基因本體和京都基因和基因組分析百科全書（GO和KEGG）

為進一步解釋miR-144-3p靶基因的功能，在Metascape中進行KEGG和GO分析。對于GO分析，使用了三個類別：BP，CC和MF。BP分析結(jié)果顯示：腎臟系統(tǒng)發(fā)育（GO：0072001）和含核堿基的小分子代謝過程（GO：0055086）是前兩個途徑（圖11a）。CC分析結(jié)果：潛在的目標差異表達基因（DEG）主要富集在中心粒（GO：0005814），高爾基體膜（GO：0000139）和線粒體包膜（GO：0005740）（圖11c）中。對于MF分析結(jié)果，三個顯著涉及的項目是：RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合（GO：0000978）;輔因子結(jié)合（GO：0048037）;和轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移糖基（GO：0016757）（圖11b）。關(guān)于KEGG，前兩個富集途徑是蛋白質(zhì)消化和吸收（hsa04974）和甲狀腺激素信號傳導途徑（hsa04919）（圖12）。 PPI蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析揭示了五個基因-C12orf5，CEP55，E2F8，STIL和TOP2A-作為hub基因，閾值為6（圖13）。