結(jié)合麥特繪譜技術(shù)團隊十多年的膽汁酸研究經(jīng)驗，王博在本期繪譜學堂分別從膽汁酸代謝、膽汁酸代謝信號通路、膽汁酸與腸道菌群研究案例三個方面向各位學員做了詳細解讀，同大家一起探討體內(nèi)膽汁酸具體代謝過程，以及作為信號因子及代謝調(diào)節(jié)因子的膽汁酸通過何種信號通路與腸道菌群相互作用影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。

按照R1\R2\R3\X位置上基團不同，其親脂性不同。按照結(jié)構(gòu)還可以將膽汁酸分為初級膽汁酸和次級膽汁酸，或者結(jié)合型膽汁酸和非結(jié)合型膽汁酸。

在膽汁酸分類中，有一種膽汁酸需要注意，就是UDCA。UDCA在老鼠體內(nèi)屬于初級膽汁酸，在人體內(nèi)屬于次級膽汁酸。目前有很多膽汁酸分類還不是很清楚。另外，還需要注意的一個問題是人體膽汁酸成分和老鼠膽汁酸成分組成是不一樣的。如下圖可以看出，人體膽汁酸中CA、CDCA、DCA、LCA等為主，而老鼠膽汁酸中CA、βMCA、ωMCA、αMCA等為主。

膽汁酸代謝比較復雜，涉及的催化反應至少包括了17種不同的酶。肝臟部位，膽固醇通過兩種不同途徑形成初級膽汁酸。經(jīng)典途徑是膽固醇經(jīng)膽固醇-7α-羥化酶（CYP7A1）催化生成7α-羥基膽固醇，進一步催化生成膽酸（CA）和鵝去氧膽酸（CDCA），CYP7A1是整條途徑的限速酶，決定膽汁酸生成量，在正常條件下至少75%的膽汁酸通過該途徑產(chǎn)生。替代途徑則由甾醇-27-羥化酶（CYP27A1）催化生成27-羥基膽固醇進一步被氧甾醇-7α-羥化酶（CYP7B1）催化生成CDCA。值得注意的是，替代途徑主要產(chǎn)生CDCA，而經(jīng)典途徑產(chǎn)生CDCA和CA，兩種初級膽汁酸的比例由甾醇-12α-羥化酶（CYP8B1）決定。除CA和CDCA外，小鼠還產(chǎn)生初級膽汁酸MCAs（主要是β-MCA）和熊去氧膽酸（UDCA）。然后與?；撬岷透拾彼徇M行結(jié)合。

生成初級膽汁酸與牛磺酸和甘氨酸進行結(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸。需要注意的是，人體中膽汁酸主要與甘氨酸結(jié)合，而小鼠和大鼠體內(nèi)膽汁酸主要與?；撬峤Y(jié)合。非結(jié)合型膽汁酸可以通過擴散穿過細胞膜，而結(jié)合型膽汁酸需要通過膽鹽輸出泵(BSEP，也稱為ABCB11)主動運輸?shù)侥懼?，并儲存在膽囊?nèi)，隨后被釋放到十二指腸。同時，也會生成硫酸化膽汁酸或葡糖醛酸化，并與甘氨酸或者?；撬徇M行結(jié)合，由多藥耐藥性相關(guān)蛋白2 (MRP2,也稱為ABCC2)分泌到膽囊中。當發(fā)生膽汁淤積時，大量的膽汁酸和膽紅素通過包括MRP3和MRP4在內(nèi)的MRP家族成員以及鈉鹽非依賴有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽2 (OATP2，也稱為SLCO1B1)、有機溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體OSTα-OSTβ異源二聚體轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)。

膽囊收縮釋放膽汁酸(以膽汁酸、膽固醇和磷脂混合的膠束形式)進入腸道，來自腸道細菌的微生物酶繼續(xù)代謝膽汁酸，甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合的CA和CDCA通過膽酸鹽水解酶(BSH)去結(jié)合和7α-脫羥基形成次級膽汁酸(DCA和LCA)。Tα-MCA和Tβ-MCA通過膽酸鹽水解酶(BSH)形成α-MCA，β-MCA。β-MCA通過C-7差向異構(gòu)化形成ω-MCA，再經(jīng)7α脫羥基形成豬去氧膽酸(HDCA)，經(jīng)過7β-差向異構(gòu)化形成豬膽酸（HCA，也稱為γMCA）。

膽汁酸去結(jié)合過程由具有膽鹽水解酶（BSH）活性的細菌主導的，參與膽汁酸代謝的腸道菌屬主要有：擬桿菌、梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌、利斯特氏桿菌等參與膽汁酸去結(jié)合；擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、埃格菌、優(yōu)桿菌、消化性鏈球菌和瘤胃球菌主要參與C3、C7和C12羥基的氧化和差向異構(gòu)化；梭狀芽胞桿菌和優(yōu)桿菌參與7-去羥基化；擬桿菌、優(yōu)桿菌和乳酸菌參與酯化反應；梭狀芽孢桿菌、梭桿菌、胃球菌和假單胞菌參與脫硫過程。

在回腸末端，大多數(shù)非結(jié)合膽汁酸(包括CA、CDCA DCA, UDCA HDCA,α-MCA,β-MCA,和ω-MCA)經(jīng)頂端鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運體(ASBT) 、MRP2等吸收進入腸上皮細胞，并分泌到門靜脈。經(jīng)過循環(huán)系統(tǒng)到達肝臟，由肝細胞鈉/?；悄懰猁}轉(zhuǎn)運多肽(NTCP)和有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽1 (OATP1)進入肝細胞。臨床上，NTCP主要負責結(jié)合膽汁酸的攝取(>80%)，而OATP家族成員主要將未結(jié)合或硫酸化膽汁酸運輸?shù)礁闻K。這樣就完成了一次肝-腸循環(huán)。每天膽汁酸池90–95%膽汁酸進行循環(huán)，一天腸道和肝臟之間循環(huán)次數(shù)大約6-10次，每天只產(chǎn)生約0.2~0.6克的新合成膽汁酸，以維持一個穩(wěn)定的膽汁酸池。

通過膽汁酸代謝通路展示圖可以看出，我們可以通過幾個方面對膽汁酸進行分析：1）膽汁酸各成分組間變化規(guī)律，膽汁酸比例變化規(guī)律，不同種類（初級和次級、結(jié)合和非結(jié)合等）膽汁酸變化規(guī)律；2）膽汁酸代謝酶變化規(guī)律（如CYP7A1、CYP27A1、CYP8B1）；3）膽汁酸轉(zhuǎn)運重吸收等受體表達變化規(guī)律（如BSEP、MRP2、ASBT）。

膽汁酸是如何發(fā)揮信號分子作用的呢？其實主要依賴于兩種關(guān)鍵的受體，一種是法尼醇X受體（FXR），它是核受體的一種，另外一種是G蛋白偶聯(lián)受體（TGR5）。

FXR在多種組織中均有表達。其中研究最多的部位是肝臟和回腸。肝FXR是膽汁酸合成和肝內(nèi)循環(huán)的主要調(diào)節(jié)因子。在正常生理條件下，肝臟FXR主要調(diào)節(jié)膽道系統(tǒng)和腸道的膽汁酸水平，限制膽汁酸在肝臟中的積累。腸道FXR維持膽汁酸回流到門靜脈，并控制膽汁酸再攝取進入腸細胞，從而限制細胞內(nèi)膽汁酸水平。遠端回腸腸細胞重吸收膽汁酸，膽汁酸激活或抑制FXR活性，誘導小鼠FGF15或者人體FGF19表達。FGF15 /19通過門靜脈到達肝臟，與FGF受體4（FGFR4）/b-klotho異二聚體復合物結(jié)合，觸發(fā)JNK1/2和ERK1/2信號級聯(lián)反應影響Cyp7a1的表達，最后調(diào)節(jié)膽汁酸的合成代謝。另外，膽汁酸激活肝臟FXR誘導小異二聚體伴侶(SHP)分子的表達，SHP與肝受體同源蛋白-1 (LRH-1)結(jié)合，從而抑制Cyp7a1基因的表達。此外，F(xiàn)XR還可以誘導其他轉(zhuǎn)運體BSEP/ABCB11、 MDR3/MDR2/ABCB4、ABCG5/ABCG8的表達影響膽汁酸代謝。TGR5主要由疏水性次級膽汁酸LCA和DCA激活，是微生物與膽汁酸相互作用的另一個靶點。TGR5的激活導致受體內(nèi)化，環(huán)磷腺苷（cAMP）水平升高，蛋白激酶A活化，導致靶蛋白磷酸化水平增加，這種活化引起的結(jié)果是廣泛的且具有細胞特異性，最終引起褐色脂肪組織能量消耗，改善葡萄糖代謝和胰島素敏感性，增加腸道運動等變化。此外，膽汁酸其他受體包括孕烷X受體PXR、維生素D受體。因此我們可以針對膽汁酸變化，選擇信號通路上的各個指標進行檢測分析。

該研究納入1464例樣本，其中認知正常370例，早期輕微認知障礙284例，晚期輕微認知障礙505例以及AD病人305例。首先確定不同階段人群膽汁酸是否發(fā)生變化，且這種變化與認知能力下降是否相關(guān)，MCI進展到AD患者中，CA水平下降，而GDCA/CA、TDCA/CA水平均上升，提示它們是評價MCI進展的標志物群。其次，對BAs與ATN (β-淀粉樣蛋白，tau蛋白，神經(jīng)退化)三種疾病生物標志物相關(guān)性進行分析；此外，結(jié)合基因檢測，進行膽汁酸與風險基因位點相關(guān)性分析。這個案例是從臨床角度出發(fā)，挖掘膽汁酸在臨床輔助診斷、評估中的應用。

案例詳細解析請點擊查閱：膽汁酸或?qū)⒊蔀榘柎暮Ｄ⌒碌纳飿酥疚?/strong>

對二甲雙胍治療前后腸道菌群進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)短期給予二甲雙胍就能夠明顯的引起腸道菌群重塑，其中脆弱擬桿菌豐度顯著被抑制。通路分析發(fā)現(xiàn)次級膽汁酸代謝受到影響。隨后采用代謝組學分析了糞便、血清中膽汁酸變化規(guī)律，其中TUDCA\GUDCA水平顯著變化。隨后對FXR等信號通路進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)腸FXR在二甲雙胍干預之后，明顯被抑制，而肝FXR卻沒有顯著改變。進一步證實GUDCA是腸FXR內(nèi)源性拮抗劑。將篩選到的脆弱擬桿菌進行灌胃，發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌可以逆轉(zhuǎn)二甲雙胍降糖作用。而補充GUDCA，糖尿病模型小鼠體重明顯減輕，血糖明顯改善，胰島素敏感性也增加了，能夠有效的治療糖尿病。

案例詳細解析請點擊查閱：Nat. Med. | 二甲雙胍通過調(diào)節(jié)腸道菌群與膽酸代謝改善葡萄糖代謝疾病

膽汁酸的信號通路疾病當中發(fā)揮極其重要的作用，是藥物干預的一類靶點。以下突變?yōu)槟懼岬膸追N藥物的研發(fā)情況。主要有CDCA及其衍生物、UDCA及其衍生物、膽汁酸螯合劑（如消膽胺）及膽汁酸轉(zhuǎn)運體ASBT抑制劑。

Q1: 做了非靶向代謝組，發(fā)現(xiàn)兩種膽汁酸出現(xiàn)顯著差異，想對這兩種膽汁酸進一步分析，有什么建議呢？

A：非靶向代謝篩選出的差異物還需要進一步驗證，如果該疾病與膽汁酸相關(guān)性比較強，可以對膽汁酸譜進行靶向絕對定量驗證一下，根據(jù)驗證結(jié)果進行后續(xù)驗證方案設計。

Q2：膽汁酸對腸道中菌群中哪類菌群影響最大？

A: 膽汁酸和腸道菌群相互影響。其中擬桿菌、梭菌、乳酸菌、雙歧桿菌、等參與膽汁酸去結(jié)合；擬桿菌、梭狀芽孢桿菌、大腸桿菌、瘤胃球菌等參與羥基氧化和差向異構(gòu)化；梭狀芽胞桿菌和優(yōu)桿菌參與7-去羥基化；擬桿菌、優(yōu)桿菌和乳酸菌參與酯化反應；梭狀芽孢桿菌、梭桿菌、胃球菌和假單胞菌參與脫硫過程?？梢酝ㄟ^飲食補充膽汁酸考察某種膽汁酸對菌群的影響。

Q3: 臨床及動物模型均顯示肝損失后，總甘油三酯和總膽汁酸存在顯著性差異，該如何進行下一步研究？  

A: 可以針對膽汁酸譜進行檢測分析，臨床上可以進行血清、糞便兩種樣本膽汁酸檢測；動物實驗可以對血清、肝臟、腸內(nèi)容物進行檢測，先選擇哪種樣本進行分析則需要根據(jù)研究目的進行選擇。目前已經(jīng)有文獻報告肝損傷中膽汁酸成分會出現(xiàn)明顯變化。

Q4: 糞便和血清中膽汁酸分別反映哪些部位膽汁酸含量？肝臟疾病是不是要特意檢測肝臟中膽汁酸？

A: 糞便膽汁酸表征由肝臟轉(zhuǎn)運至腸道的環(huán)節(jié)（腸道膽汁酸升高可能是腸道重吸收受阻或者肝臟分泌過多）、血清表征整體狀態(tài)（血清膽汁酸過多可能是腸道重吸收增加，也有可能是肝臟膽汁酸淤積）、肝臟部位主要還是表征膽汁酸合成。三個部位全部分析才會更系統(tǒng)的闡述清楚哪個部位的功能出現(xiàn)異常。

Q5: 研究腸道腫瘤和膽汁酸的關(guān)系時，糞便和血液膽汁酸優(yōu)選哪一個？

A: 如果從機制方面進行研究可以選擇糞便膽汁酸，同時可以對菌群去進行檢測，兩部分結(jié)果可以進行相關(guān)性分析，探討群菌-膽汁酸-疾病三者之間的關(guān)系。如果尋找生物標志物，血清會更好一些，臨床方面收集血樣更方便。選擇哪種樣本，還是要根據(jù)研究目的進行判斷。