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最近經(jīng)常會(huì)被問(wèn)到： 小囧：靜脈血，檢測(cè)胎兒，WES，DNA 是總DNA 還是必須用cfDNA？ 技術(shù)：收到問(wèn)題趕緊查，嗯，用cfDNA 可以檢測(cè)胎兒的遺傳變異。 小囧：那測(cè)序深度100乘夠用嗎? 技術(shù)：然后又查，似乎不夠，原因是cfDNA 總量本來(lái)就少，胎兒游離DNA 更少，必須有足夠的深度來(lái)保證測(cè)到足夠的有效數(shù)據(jù)。 小囧：那需要多少ng cfDNA 呢？ 技術(shù)：收到，又查…….. 此處省略好多行~~ 得嘞，作為一名技術(shù)人員，是該總結(jié)總結(jié)網(wǎng)紅cfDNA 基本知識(shí)了。 來(lái)來(lái)來(lái)，樊老師要講課了，此處應(yīng)有文章~   圖A cf DNA片段示意圖概述 這是一篇2016年發(fā)表在Cell 上的文章，cfDNA 含有體內(nèi)核小體足跡可知其組織起源。從這篇文章中我們挖掘到我們想要的答案。 Q1 cfDNA的來(lái)源？ 如圖A，細(xì)胞凋亡或壞死導(dǎo)致的天然染色質(zhì)幾乎完全降解。裸露的DNA 片段在細(xì)胞凋亡時(shí)就被胞內(nèi)的核酸酶降解掉了，而蛋白結(jié)合的DNA 片段由于蛋白包被能免受核酸酶的降解被釋放到血液循環(huán)中。經(jīng)蛋白酶處理后，可從外周血漿中回收蛋白結(jié)合的DNA 片段。在健康個(gè)體中，cfDNA 主要來(lái)源于骨髓和淋巴細(xì)胞，但在某些疾病過(guò)程或生理?xiàng)l件下，可能存在來(lái)自一個(gè)或多個(gè)另外的組織的來(lái)源。 Q2 cfDNA的片段分布？ 如下圖B和D，片段長(zhǎng)度分布的peak 在167 bp 處（“核小體+連接組蛋白”對(duì)應(yīng)的峰），在100-160 bp 范圍內(nèi)有10.4 bp 的周期性波動(dòng)。 cfDNA 的片段分布與核小體的結(jié)構(gòu)有關(guān)，如下圖E，每個(gè)核小體單位包括一個(gè)組蛋白八聚體、DNA 分子及一分子H1 ；組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的盤(pán)狀核心結(jié)構(gòu)（NCP，nucleosome core particle）；146 bp 的DNA分子超螺旋盤(pán)繞組蛋白八聚體1.75圈，組蛋白H1 在核心顆粒外結(jié)合額外20bp DNA，鎖住核小體DNA 的進(jìn)出端，起穩(wěn)定核小體的作用。 圖B-F cfDNA片段分布和核小體結(jié)構(gòu)示意圖 因此不難理解cfDNA 的片段分布特點(diǎn)，如圖F，核酸酶會(huì)降解相鄰核小體之間的連接DNA，即裸露的DNA，纏繞在NCP 上的DNA 會(huì)被保護(hù)，纏繞在核心顆粒上的147bp 加上H1蛋白結(jié)合的20bp 對(duì)應(yīng)著167bp 的主峰（本篇文章是167 bp的主峰，有的文章是166bp），這些DNA 會(huì)發(fā)生與DNA 螺距相關(guān)的切口或者裂解，對(duì)應(yīng)著100-160bp 的范圍。 Q3 cfDNA的含量？ 普通健康人中 cfDNA 含量低，超過(guò) 90% 的健康個(gè)體每毫升血漿中的 cfDNA 量不超過(guò)25ng。 在孕婦中，胎兒的cfDNA 來(lái)自于胎盤(pán)滋養(yǎng)層，現(xiàn)在cfDNA 可用于在高危孕婦中篩查胎兒的遺傳缺陷，這就是當(dāng)前火熱的無(wú)創(chuàng)唐氏篩查的基礎(chǔ)！一般情況下，胎兒的游離DNA 含量較低，有研究表明12孕周后的胎兒游離DNA 含量較穩(wěn)定，達(dá)4%以上，可滿(mǎn)足NIPT 的檢測(cè)需求。 Q4 cfDNA穩(wěn)定嗎？ 研究表明，cfDNA 的半衰期僅有1~2個(gè)小時(shí)，在外周血中處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的不斷變化的過(guò)程，其含量取決于cfDNA 的來(lái)源。因此收到用于cfDNA 檢測(cè)的全血樣本時(shí)，最好是先提取。如果沒(méi)法立刻提取，需要先將血漿離心出來(lái)，然后放到 -80度存放。不過(guò)市面上有賣(mài)能保存一定時(shí)間的全血樣品中游離cfDNA 的保存管。 Q5 什么是ctDNA（circulating tumor DNA）？ ctDNA 是來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的cfDNA，屬于cfDNA 的一種類(lèi)型。兩者為包含關(guān)系，ctDNA 僅為cfDNA 很小的一部分。 雖然ctDNA 所占cfDNA 的比例波動(dòng)范圍非常大，約0.01％～90％，有研究表明半數(shù)以上突變頻率在0.4%以下，但實(shí)際上，大多數(shù)ctDNA 在cfDNA 中的占比約為0.2%。因此，ctDNA 的檢測(cè)需要技術(shù)靈敏度較高，目前比較適用的技術(shù)包括數(shù)字PCR技術(shù)和結(jié)合UMI 的NGS 技術(shù)，靈敏度分別可以達(dá)到0.01%和0.1%左右。 Q6 ctDNA用于腫瘤檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)？ 在腫瘤患者中，ctDNA 可存在于血漿、血清、腦脊液中。ctDNA 的檢測(cè)貫穿于腫瘤診療的全過(guò)程。 ① 在腫瘤早期的篩查中，ctDNA 檢測(cè)可早于影像學(xué)發(fā)現(xiàn)癌癥，通過(guò)抽血來(lái)檢測(cè)血液 ctDNA所攜帶的腫瘤基因組信息，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治療。 ② 在腫瘤治療的過(guò)程中，ctDNA 可提相關(guān)供腫瘤藥物靶點(diǎn)基因的突變信息，指導(dǎo)醫(yī)生個(gè)性化用藥；也可對(duì)病人用藥后的療效進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。ctDNA 的檢測(cè)尤其是對(duì)于一些晚期的難以獲取腫瘤組織的患者更為重要。  圖G 血液中cfDNA的釋放和提取 目前市場(chǎng)的液體活檢主要針對(duì)的是CTCs 和cfDNA，如上圖G，形象的描繪除了外周血中形形色色的細(xì)胞和游離核酸。下面簡(jiǎn)單介紹下CTC。 Q7 什么是CTC（Circulating tumor cell）？ CTC，即循環(huán)腫瘤細(xì)胞，是指從實(shí)體瘤中脫離出來(lái)并進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。通常在臨檢中應(yīng)用的CTC，特指在檢測(cè)時(shí)仍具有活性的細(xì)胞。這里的具有活性指的是細(xì)胞是活的，能自己增殖，對(duì)藥物有反應(yīng)，即具有一切活細(xì)胞的特性。另一方面，活的CTC提供的信息更多。 Q8 CTC 的含量？ 釋放到血液中的絕大多數(shù) CTC 發(fā)生凋亡，只有極少數(shù)細(xì)胞能存活下來(lái)并在合適條件下重新穿出血管，最終在適宜的器官形成肉眼可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移。有研究表明，CTC 的半衰期只有 1.0 ~ 2.4 h。因此CTC 在外周血的數(shù)量極其稀少，通常每1×106 ~ 1×107個(gè)單核細(xì)胞中才會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè) CTC。 Q9 CTC 檢測(cè)臨床意義？ CTC 檢測(cè)的臨床意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面: ① 早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移：有研究表明 CTC 檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移； ② 評(píng)估預(yù)后：Cristofanilli等在一項(xiàng)多中心、前瞻性、隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)中，檢測(cè) 177 例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者 7.5 ml 外周血中CTC 的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)治療前外周血中 CTC≥5 個(gè) / 7.5ml 外周血患者與 CTC ＜5 個(gè) / 7.5 ml 外周血患者相比，預(yù)后較差， CTC 可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后評(píng)估的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素； ③ 指導(dǎo)個(gè)體化治療: CTC 計(jì)數(shù)和分子分型為制定個(gè)體化治療方案提供依據(jù)。 |
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