胃癌是最為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，也是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一^[1]。全世界每年新發(fā)病例有70%在發(fā)展中國(guó)家，其中我國(guó)每年新增病例大約占全球的40%^[2]，且患者趨于年輕化。盡管近年來(lái)對(duì)于胃癌早期的診療技術(shù)、外科切除技術(shù)以及放化療和免疫治療等多種綜合治療技術(shù)有所提高，但是患者5年生存率僅為25%～30%^[3-4]，術(shù)后胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移仍然是影響預(yù)后和5年生存率的主要因素。如何有效地改善進(jìn)展期胃癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移仍然是臨床上面臨的一大難題。目前，眾多研究證明中藥在抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等方面展現(xiàn)出較高的研究?jī)r(jià)值。

重樓Rhizoma Paridis以蚤休之名首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其具有清熱解毒、消腫止痛的功效?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理學(xué)研究證實(shí)從重樓中以醇提方式提取出來(lái)的化合物是天然的皂苷類成分，即重樓皂苷（Rhizoma Paridis total saponin，RPTS），也是抗腫瘤的主要活性成分^[5-7]。近年來(lái)大量研究展示了RPTS在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯癌細(xì)胞周期、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等方面具有顯著的作用^[8-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RPTS具有明顯的抑制胃癌細(xì)胞增殖的活性^[12-13]。研究表明氯化鋰（LiCl）能夠抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、環(huán)加氧酶-2（COX-2）等腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)^[14-15]，參與了腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，血管生成以及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移^[16]。基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)研究RPTS對(duì)LiCl誘導(dǎo)的人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討可能的作用機(jī)制。

1  材料

1.1  細(xì)胞

MKN-45細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2  藥物與試劑

重樓飲片購(gòu)自安徽濟(jì)仁藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為云南，批號(hào)111012，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與資源教研室俞年軍教授鑒定，確認(rèn)為云南重樓Paris polyphylla Smith var. yannanensis (Franch) Hand. -Mazz。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、LiCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Transwell小室（直徑8 μm）購(gòu)自Millipore公司；MMP-9 ELISA試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、COX-2抗體、GSK-3β抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；TRIzol RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、TRIzol RNA提取試劑、QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.3  儀器

Forma 370細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；純水-超純水凈化器（美國(guó)Millipore公司）；7500 Real-Time PCR儀（美國(guó)ABI公司）；SPEC-TRAMax M2e酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；FCM凝膠成像儀（美國(guó)Protein Simple公司）；PowerPac系列電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2  方法

2.1  PRTS的制備

2.2  細(xì)胞培養(yǎng)

MKN-45細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO₂及飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至瓶壁85%左右后按照1∶5進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.3  MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞用胰酶常規(guī)密度10⁴個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液以200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO₂的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別向各孔中加入終質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL RPTS，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組，繼續(xù)培養(yǎng)24h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入5 mg/mLMTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，吸出上清后加入150 μLDMSO，搖床避光震搖15 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在490 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力＝(A_{實(shí)驗(yàn)}―A_空白)/(A_對(duì)照―A_空白)

2.4  細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至7×10⁵個(gè)/mL，接種于6孔板中。置于37 ℃、5% CO₂的飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞貼壁，用10 μL槍頭在孔板底部中央均勻劃出一條橫線，PBS清洗后，換無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)，并在光學(xué)顯微鏡下觀察0 h細(xì)胞劃痕狀態(tài)，拍照。之后向各孔中分別加入終質(zhì)量濃度為0、2.5、5.0、10.0 μg/mL的RPTS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后在光學(xué)顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞遷移情況，并計(jì)算細(xì)胞24 h遷移率。

遷移率＝(劃痕寬度_{0 h}－劃痕寬度_24h)/劃痕寬度_{0 h}

2.5  Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱中隔夜解凍，次日Matrigel基質(zhì)膠和預(yù)冷的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液按1∶3稀釋混合均勻，在Transwell小室內(nèi)加入100 μL混合液并均勻鋪展，放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置2 h，使基質(zhì)膠凝固。將Transwell小室置

2.6  ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中MMP-9的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至7×10⁵個(gè)/mL，接種至6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞加LiCl（5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后換液，加入不同質(zhì)量濃度RPTS（10、20、40 μg/mL），各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸出細(xì)胞上清液至1.5 mL EP管中，各組樣品和緩沖液按1∶5稀釋依次加入MMP-9 Elisa試劑盒當(dāng)中，每孔50 μL，同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品組，置于37℃恒溫條件下孵育30 min，按說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀讀取480 nm處A值，記錄結(jié)果。

2.7  Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至7×10⁵個(gè)/mL，接種至6孔板中。待細(xì)胞貼壁后，除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞加LiCl（5 mmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液，并加入不同質(zhì)量濃度RPTS（10、20、40 μg/mL）放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束，棄去上清培，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育2 h。避光配制ECL發(fā)光試劑，并均勻涂抹在PVDF膜上蛋白條帶對(duì)應(yīng)位置，于FCM凝膠成像儀中自動(dòng)曝光。所得實(shí)驗(yàn)蛋白條帶圖像經(jīng)凝膠圖像處理系統(tǒng)加以分析。

2.8  qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表達(dá)

將已接種于6孔板中的MKN-45細(xì)胞經(jīng)過(guò)LiCl（5 mmol/L）處理24 h后，加入RPTS（10、20、40 μg/mL）繼續(xù)處理24 h，收集細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，取少量RNA進(jìn)行定量，之后取總RNA 1 μg/μL，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。再根據(jù)QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列為β-actin：上游5’-GAGAAAATCTG- GCACGSK-3β：上游5’-GAACTGTCAAG- TAATCCACCTCT-3’，下游5’-CCACGGTCTCCAG- TATTAGCATC-3’；VEGF：上游5’-TCACCAAGGC-

2.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，各組指標(biāo)采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較采用t檢驗(yàn)。

3  結(jié)果

3.1  RPTS對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RPTS 2.5 μg/mL組細(xì)胞活力受到影響較小。當(dāng)RPTS質(zhì)量濃度增加到5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制（P＜0.05、0.001），并且隨著質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞活力降低。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2  RPTS對(duì)MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL組細(xì)胞的劃痕距離顯著增加（P＜0.01、0.001），結(jié)果提示RPTS可顯著抑制MNK-45細(xì)胞的遷移，而且遷移抑制作用呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.3  RPTS對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室下室細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色，通過(guò)對(duì)下室細(xì)胞數(shù)量的觀察，可以看出與對(duì)照組比較，RPTS 2.5、5.0、10.0 μg/mL組下室侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05、0.001），且表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性，結(jié)果提示RPTS能抑制MKN-45細(xì)胞的侵襲，結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.4  RPTS對(duì)LiCl誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示（表1），與對(duì)照組比較，LiCl可顯著提高MKN-45細(xì)胞中MMP-9蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），提示LiCl造模成功。與模型組比較，RPTS 10、20、40 μg/mL可顯著抑制MMP-9蛋白的表達(dá)，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性。

3.5  RPTS對(duì)LiCl誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞VEGF、COX-2、GSK-3β蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞VEGF、COX-2蛋白表達(dá)產(chǎn)生了顯著的抑制作用（P＜0.01）。RPTS可上調(diào)LiCl抑制的GSK-3β蛋白表達(dá)水平（P＜0.05、0.01），提示RPTS。

3.6  RPTS對(duì)LiCl誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞VEGF、COX-2、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與模型組比較，RPTS 10、20、40 μg/mL對(duì)LiCl誘導(dǎo)的MKN-45細(xì)胞VEGF、COX-2 mRNA表達(dá)產(chǎn)生了顯著的抑制作用，與Western blotting結(jié)果一致。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞GSK-3β表達(dá)無(wú)明顯差異，提示LiCl可能僅在蛋白水平調(diào)控GSK-3β的表達(dá)。與模型組比較，RPTS 20、40 μg/mL組細(xì)胞GSK-3β mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)圖5。

4  討論

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，在我國(guó)各種惡性腫瘤中發(fā)病率居首位。胃癌發(fā)病有明顯的地域性差別，在我國(guó)胃癌高發(fā)的地區(qū)主要集中在東部沿海和中西部的黃河中上游地區(qū)。此外，男女發(fā)病率為2∶1，并且隨年齡的增加而顯著升高。據(jù)我國(guó)腫瘤登記中心最新數(shù)據(jù)調(diào)查結(jié)果估計(jì)，2015年我國(guó)胃癌的新發(fā)病例約為67.9萬(wàn)例，胃癌死亡病例約為49.8萬(wàn)例^[22]，因此胃癌已是威脅我國(guó)居民健康的主要疾病之一?？刂七M(jìn)展期胃癌細(xì)胞的高侵襲和高轉(zhuǎn)移性是改善患者預(yù)后、減少死亡率的有效途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，RPTS可抑制MKN-45細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究中選用LiCl作為對(duì)MKN-45細(xì)胞的外源性誘導(dǎo)物，模擬Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活情況下對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LiCl處理細(xì)胞24 h后，MKN-45細(xì)胞中MMP-9、VEGF、COX-2蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，但RPTS能逆轉(zhuǎn)以上作用，并表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。RPTS對(duì)LiCl作用位點(diǎn)GSK-3β蛋白也表現(xiàn)出明顯的調(diào)控作用。

綜上所述，RPTS可抑制MKN-45細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步探索和研究，為更多的臨床應(yīng)用提供參考。

參考文獻(xiàn)（略） 

來(lái)  源：洪星輝，王  靚，梁夢(mèng)茹，黃金玲. 重樓總皂苷對(duì)LiCl誘導(dǎo)人胃癌MKN-45細(xì)胞遷移及侵襲的影響 [J]. 中草藥, 2019, 50(13):3134-3139.