越來越多的證據(jù)表明，腫瘤新生抗原在產(chǎn)生自發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)和預(yù)測免疫治療的臨床反應(yīng)中具有重要作用。盡管患者中存在大量新生抗原，但由于未能獲得足夠和持久的抗腫瘤免疫反應(yīng)，因而不能完全消除腫瘤。鑒定針對腫瘤新抗原特異性免疫反應(yīng)的信號(hào)通路可以為免疫治療提供新的有效靶點(diǎn)。今年2月，中科院北京基因組研究所韓大力為第一作者，清華大學(xué)徐萌（Meng Michelle Xu）、美國芝加哥大學(xué)何川作為共同通訊作者在Nature上發(fā)表了題為Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6Amethylation and YTHDF1 in dendritic cells的研究論文，揭示了RNA m6A修飾通過調(diào)控樹突狀細(xì)胞的溶酶體組織蛋白酶翻譯效率，影響腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答新機(jī)制。

m6A修飾是mRNA上目前已知最豐富的修飾，負(fù)責(zé)mRNA的翻譯后調(diào)控。m6A的調(diào)控功能主要由結(jié)合蛋白發(fā)揮作用。其中，YTHDF1能通過識(shí)別mRNA上的修飾并影響靶標(biāo)基因的翻譯。m6A相關(guān)分子的失調(diào)影響致癌基因的表達(dá)，從而將腫瘤發(fā)生發(fā)展與m6A關(guān)聯(lián)。在這篇論文中，作者發(fā)現(xiàn)m6A閱讀蛋白YTHDF1通過識(shí)別帶有m6A修飾的RNA來調(diào)控新生抗原免疫相關(guān)蛋白。與野生型小鼠相比，Ythdf1-/-缺陷小鼠顯示抗原特異性CD8+ T細(xì)胞抗腫瘤應(yīng)答上升。經(jīng)典樹突狀細(xì)胞中YTHDF1的缺失增強(qiáng)了腫瘤抗原的交叉表達(dá)和體內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的交叉呈遞。從機(jī)制上講，編碼溶酶體蛋白酶的轉(zhuǎn)錄物被m6A標(biāo)記并被YTHDF1蛋白識(shí)別。YTHDF1增加了樹突狀細(xì)胞中溶酶體組織蛋白酶的翻譯，抑制組織蛋白酶顯著增強(qiáng)了野生型樹突狀細(xì)胞的交叉表達(dá)。此外，在ythdf1?/?小鼠中，PD-L1的治療效果顯著增強(qiáng)，表明YTHDF1是腫瘤免疫治療的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

    m6A甲基化從上游到下游的基本機(jī)制及m6A甲基化酶的主要類型如下：

（自：Yang Y, Hsu PJ, Chen YS,Yang YG. Dynamic transcriptomic m(6)A decoration: writers, erasers, readers andfunctions in RNA metabolism. Cell Res. 2018 Jun;28(6):616-624）

1.CD8+ T細(xì)胞在Ythdf1-/-小鼠中，是腫瘤控制的一個(gè)十分關(guān)鍵的必要條件

    作者首先對野生型（WT）和Ythdf1敲除（Ythdf1-/-）小鼠分別皮下接種黑色素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Ythdf1-/-小鼠的腫瘤生長被顯著抑制。相比于野生型小鼠，Ythdf1-/-小鼠的腫瘤組織中含有更多的免疫浸潤CD8+ T細(xì)胞和自然殺傷性細(xì)胞（natural killer cells, NKcells）。由于CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞都是控制腫瘤生長的關(guān)鍵。因此，作者進(jìn)一步分析了兩種細(xì)胞對Ythdf1-/-小鼠抗腫瘤能力的貢獻(xiàn)程度。研究發(fā)現(xiàn)WT小鼠和Ythdf1-/-小鼠的NK細(xì)胞表現(xiàn)出類似的脫粒反應(yīng)， NK細(xì)胞的缺失對Ythdf1-/-小鼠的腫瘤生長沒有影響。相反，在沒有CD8+T細(xì)胞的情況下，ythdf1-/-小鼠的抗腫瘤反應(yīng)被完全消除。表明CD8+ T細(xì)胞是Ythdf1-/-小鼠抗腫瘤的必要條件（Fig.1）。

2.Ythdf1-/-小鼠中樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力顯著增強(qiáng)

為進(jìn)一步確定小鼠體內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生針對腫瘤新抗原的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，作者分析了野生型和Ythdf1-/-小鼠中表達(dá)針對SIINFEKLMHC-I復(fù)合物的腫瘤浸潤的CD8+ T細(xì)胞所占比例（即對腫瘤抗原特異識(shí)別的CD8+T細(xì)胞）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)盡管野生型小鼠沒有在腫瘤內(nèi)積累抗原特異性CD8+T細(xì)胞，但是在Ythdf1-/-小鼠體內(nèi)對腫瘤新抗原的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增加的趨勢。為了研究新抗原特異性CD8+T細(xì)胞在Ythdf1-/-小鼠體內(nèi)的浸潤是否是由于早期自發(fā)的CD8+T細(xì)胞啟動(dòng)增強(qiáng)所致，作者使用OVA介導(dǎo)的SIINFEKL多肽或腫瘤細(xì)胞在體外刺激了DLNs淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞。同時(shí)通過ELISPOT檢測干擾素-γ（IFNγ）量高低，來測定內(nèi)源性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。

    用抗原刺激引流淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞并檢測CD8+ T細(xì)胞的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)Ythdf1-/-小鼠的T細(xì)胞能產(chǎn)生更多的γ干擾素細(xì)胞，表明宿主細(xì)胞中YTHDF1的敲除在早期階段即可增強(qiáng)T細(xì)胞的活化。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞本身Ythdf1的敲除只能引起小鼠抗腫瘤能力的微弱提升。又因?yàn)闃渫粻罴?xì)胞（Dendritic Cells, DCs）是主要的抗原提呈細(xì)胞。因此研究者提出假設(shè)，在Ythdf1敲除小鼠中，可能是由于DCs抗原提呈能力的增強(qiáng)而導(dǎo)致T細(xì)胞更好的活化，進(jìn)而提高了T細(xì)胞的腫瘤識(shí)別能力。為了驗(yàn)證這一假說，作者將Ythdf1敲除的DCs和野生型DCs與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，再分別將純化的DCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)來檢測其抗原提呈能力，發(fā)現(xiàn)Ythdf1-/- DCs可以更好地交叉提呈腫瘤抗原給T細(xì)胞。而后在Mettle14缺陷的DCs中也得到了一致的結(jié)論。綜上可以確認(rèn)，m6A與YTHDF1是DCs中限制抗原提呈的關(guān)鍵因素。檢測DCs的抗原提呈復(fù)合物，進(jìn)一步確認(rèn)了Ythdf1-/- DCs中表觀修飾對其抗原提呈的調(diào)控作用。此外，在小鼠中DCs中特異性敲除Ythdf1，也能夠引起強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答（Fig. 2）。

3.RIP-seq+m6A-seq+Ribo-seq聯(lián)合分析揭示溶酶體組織蛋白酶是YTHDF1主要靶基因并影響T細(xì)胞交叉呈遞能力

為確定m6A和Ythdf1在DCs中主要的調(diào)控功能，通過對野生型和Ythdf1-/-的DCs進(jìn)行建庫與測序，分析DCs中的YTHDF1的結(jié)合位點(diǎn)，m6A修飾位點(diǎn)和核糖體結(jié)合圖譜。通過計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)YTHDF1敲除后大多數(shù)基因翻譯效率顯著下降，特別是被YTHDF1結(jié)合且?guī)в?/span>m6A修飾的基因。且與預(yù)期一致，Ythdf1的缺陷并不會(huì)對m6A的分布產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。通過KEGG富集分析，表明被YTHDF1結(jié)合且翻譯下調(diào)的基因主要富集在吞噬小體和溶酶體相關(guān)的通路上。根據(jù)已有報(bào)道證實(shí)，限制DCs中溶酶體的蛋白質(zhì)水解能減少DCs內(nèi)抗原的破壞。由于組織蛋白酶負(fù)責(zé)DCs溶酶體中抗原的降解，而這些酶不僅大多數(shù)含有m6A修飾且被YTHDF1結(jié)合，同時(shí)在Ythdf1-/-DCs中也被明顯抑制。綜上可得，溶酶體組織蛋白酶大多受YTHDF1調(diào)控，從而影響DCs的交叉提呈能力，因此編碼溶酶體組織蛋白酶的RNA是YTHDF1的主要靶點(diǎn)，并隨后影響樹突狀細(xì)胞的交叉呈遞能力。（Fig.3）。

Ythdf1-/-經(jīng)典樹突狀細(xì)胞中，m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率降低，組織蛋白酶的蛋白水平下降，延緩了新生抗原的降解，從而促進(jìn)內(nèi)體或溶酶體中抗原的持續(xù)釋放，最終有助于提升Uthdf1-/-樹突狀細(xì)胞中抗原呈遞。接下來作者將WT小鼠和Ythdf1-/-小鼠中的GMDCs與B16-OVA細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Ythdf1-/-的GMDCs中OVA殘留比Ythdf1+/+的GMDCs更多。使用蛋白酶抑制劑E64、CA-074和CasIII處理后，顯著提升了WT樹突狀細(xì)胞交叉呈遞效率。此外在WT小鼠中，組織蛋白酶被抑制后顯著改善了體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)，表明組織蛋白酶是決定該小鼠模型中抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵因素（ExtendedData Fig. 8）。

    因此，樹突狀細(xì)胞中YTHDF1的缺失限制了溶酶體蛋白酶的表達(dá)，從而減弱抗原降解，最終改善CD8+ T細(xì)胞的交叉呈遞能力。

4.YTHDF1調(diào)控蛋白水解酶來促進(jìn)腫瘤生長

作者研究了新生抗原特異性CD8+T細(xì)胞在YTHDF1缺失后，能否增強(qiáng)對免疫檢查點(diǎn)阻斷（T細(xì)胞抑制劑受體PD-1）的抗腫瘤反應(yīng)。由于IFNγ在Ythdf1-/-小鼠在CD8+T細(xì)胞中顯著增加，并且IFNγ信號(hào)上調(diào)了PD-1的配體PD-L1的表達(dá)。與WT小鼠相比，Yhdf1-/-荷瘤小鼠的腫瘤細(xì)胞中PD-L1表達(dá)增加，而對IFNγ進(jìn)行中和后則降低了PD-L1的表達(dá)。

接下來為了測試PD-L1阻斷能否增強(qiáng)Uthdf1-/-小鼠抗腫瘤反應(yīng)，作者對Uthdf1-/-荷瘤小鼠和WT荷瘤小鼠中分別同時(shí)使用抗PD-L1抗體（anti-PD-L1antibody）進(jìn)行治療。盡管40%的Ythdf1-/-小鼠腫瘤組織未經(jīng)治療就發(fā)生了消退，但經(jīng)抗PD-L1抗體治療后，Ythdf1-/-小鼠的腫瘤組織幾乎顯示出完全消退。而WT小鼠在經(jīng)過抗PD-L1抗體治療后也僅表現(xiàn)出腫瘤組織的部分消退。換句話說，通過將YTHDF1敲除，與針對PD-L1的檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合，在小鼠模型中得到了幾乎完全的腫瘤控制，不是40%的反應(yīng)，而是接近100%的患黑色素瘤的小鼠對PD-L1抑制劑有反應(yīng)。而這一機(jī)制——YTHDF1表達(dá)與CD8+T細(xì)胞數(shù)的負(fù)相關(guān)性，在結(jié)直腸癌的病患中也得到了證實(shí)。因此，免疫檢查點(diǎn)阻斷和YTHDF1基因缺失可能是改善部分患者免疫檢查點(diǎn)阻斷不良預(yù)后的一種新的治療策略（Fig.4）。

    目前已知的研究表明，腫瘤即便有新抗原表達(dá)，也能逃逸免疫識(shí)別。本研究結(jié)果揭示了在DCs中，被m6A修飾的溶酶體蛋白酶mRNA能被YTHDF1識(shí)別。而YTHDF1的結(jié)合促進(jìn)了溶酶體蛋白酶的翻譯，從而抑制了其對抗原的交叉提呈能力。這一新的機(jī)制使得YTHDF1可能成為免疫療法的治療靶點(diǎn)，可與新出現(xiàn)的檢查點(diǎn)抑制劑或DCs疫苗相結(jié)合，促進(jìn)臨床腫瘤的治療效果?？偟膩碚f，這個(gè)研究從mRNA表觀修飾的這角度，給免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的提升，帶來了新的機(jī)會(huì)。由于YTHDF1基因敲除在小鼠身上耐受較好，甚至沒有觀察到任何可測量的毒性。研究人員希望在未來的一年內(nèi)，在人身上檢測這個(gè)新型療法。

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