近年來，以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，但該技術(shù)目前存在的一系列問題使其在臨床治療應(yīng)用中遭遇瓶頸。問題的根源之一在于當(dāng)前的基因編輯體系依賴于外源編輯酶或效應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而造成：(1) 蛋白分子量過大使得通過病毒載體進(jìn)行裝載及人體內(nèi)遞送十分困難；(2) 由蛋白過表達(dá)引起的DNA/RNA水平的脫靶效應(yīng)；(3) 由外源蛋白表達(dá)引起的機(jī)體免疫反應(yīng)及損傷；(4) 機(jī)體內(nèi)的預(yù)存抗體使外源編輯酶或效應(yīng)蛋白被中和從而導(dǎo)致基因編輯失敗等。為解決上述問題，亟需建立新型基因編輯工具，特別是擺脫傳統(tǒng)技術(shù)依賴于外源蛋白表達(dá)的桎梏。

ADAR(Adenosine deaminase acting on RNA) 是一類在人體內(nèi)各組織中廣泛表達(dá)的腺苷脫氨酶，能夠催化RNA分子中腺苷A→肌苷I（鳥苷G）的轉(zhuǎn)換。相比DNA編輯，RNA編輯不需要對基因組序列進(jìn)行永久性改變，這種可逆的、易于調(diào)控的編輯方式在安全性上可能更具優(yōu)勢。麻省理工學(xué)院張鋒課題組曾報道，過表達(dá)Cas13-ADAR融合蛋白及向?qū)NA可以實現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA的精準(zhǔn)編輯【1】，但是該方法無法解決外源蛋白表達(dá)造成的問題。

2019年7月16日，北京大學(xué)魏文勝課題組以長文形式在Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了題為Programmable RNA editing byrecruiting endogenous ADAR using engineered RNAs的研究論文，首次報道了名為LEAPER的新型RNA 單堿基編輯技術(shù)。與傳統(tǒng)的核酸編輯技術(shù)需要向細(xì)胞同時遞送編輯酶（如Cas蛋白）及向?qū)NA不同，LEAPER系統(tǒng)僅需要在細(xì)胞中表達(dá)向?qū)NA即可招募細(xì)胞內(nèi)源脫氨酶實現(xiàn)靶向目標(biāo)RNA的編輯。利用該技術(shù)，研究人員在一系列疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本中實現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)的編輯，并成功修復(fù)了來源于Hurler綜合征病人的α-L-艾杜糖醛酸酶缺陷細(xì)胞。該技術(shù)的建立為生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和疾病治療提供了一種全新的工具。

魏文勝課題組在研究中首次發(fā)現(xiàn)，只需轉(zhuǎn)入一條特殊設(shè)計的RNA (arRNA, ADAR-recruiting RNA)，就能夠通過招募細(xì)胞內(nèi)源的ADAR1 蛋白對靶向基因轉(zhuǎn)錄本上特定的腺苷產(chǎn)生高效精準(zhǔn)的編輯，并不需要引入任何外源效應(yīng)蛋白。ADAR1基因敲除與回補(bǔ)實驗和高通量測序分析表明，細(xì)胞內(nèi)源的ADAR1 蛋白介導(dǎo)了這一過程。這種新型RNA編輯技術(shù)被命名為LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)。

深入研究表明LEAPER具有廣泛的適用性，能對RNA分子上絕大多數(shù)的腺苷酸位點進(jìn)行精準(zhǔn)編輯。在人的原代細(xì)胞-包括肺成纖維細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及T細(xì)胞中，LEAPER的編輯效率最高可達(dá)80%，顯示出該技術(shù)在疾病治療中巨大的應(yīng)用前景。在諸多應(yīng)用嘗試中，LEAPER的高效、精準(zhǔn)的特性得到充分驗證。比如LEAPER可以通過修復(fù)抑癌基因TP53中的致病突變來恢復(fù)p53突變體的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。此外，在Hurler綜合征患者來源的原代細(xì)胞中，LEAPER能夠成功修復(fù)致病突變，并恢復(fù)細(xì)胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。

近期的研究表明，DNA單堿基編輯技術(shù)，包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器在RNA或DNA水平上產(chǎn)生了嚴(yán)重的脫靶現(xiàn)象【2-5】，引發(fā)人們對其安全性的擔(dān)憂。利用RNA-Seq技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組水平對LEAPER技術(shù)進(jìn)行的評估，沒有觀測到明顯的脫靶現(xiàn)象，顯示了新技術(shù)的高度特異性。另外，LEAPER不影響內(nèi)源ADAR蛋白的正常功能，也不會激活細(xì)胞中的天然免疫反應(yīng)，表明其是一類安全的基因編輯工具。

與RNAi類似，LEAPER充分利用了細(xì)胞中天然存在的機(jī)制：僅用一條RNA 就實現(xiàn)了精確高效的RNA單堿基編輯，從而避免了任何由于表達(dá)外源效應(yīng)蛋白而引起的各種潛在問題。這種新型的基因編輯技術(shù)在科學(xué)研究和疾病治療中顯示出可觀的優(yōu)勢與潛能，同時也為發(fā)展基于細(xì)胞內(nèi)源機(jī)制的基因編輯技術(shù)指明了方向。近期，Thorsten Stafforst課題組報道了命名為RESTORE(recruiting endogenous ADAR to specific transcripts foroligonucleotide-mediated RNA editing) 的RNA編輯方法【6】。與LEAPER類似，RESTORE也能夠利用內(nèi)源ADAR進(jìn)行靶向RNA的精準(zhǔn)編輯；不同之處在于，RESTORE中的向?qū)NA是一段化學(xué)合成的寡核苷酸，為保持其穩(wěn)定性，需要進(jìn)行大量化學(xué)修飾。而LEAPER可以通過穩(wěn)定表達(dá)的方式在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此適用于裝載至腺相關(guān)病毒 (AAV)、慢病毒等載體中，在遞送至機(jī)體后持續(xù)發(fā)揮功能。

北京大學(xué)魏文勝課題組博士生璩良(PTN)、伊宗裔(CLS)、王春慧(BIOPIC)、曹中正(CLS)、博士后朱詩優(yōu)、副研究員周卓博士和博雅輯因生物科技有限公司袁鵬飛博士為該論文共同第一作者，魏文勝為該論文通訊作者。

周海波、楊輝（中科院神經(jīng)所）

RNA單堿基編輯是近年來廣受關(guān)注的一項技術(shù)，因為 RNA水平的編輯不會產(chǎn)生永久突變，意味著其可能會作為一種更加安全的編輯手段。2017年，張鋒實驗室通過過表達(dá)Cas13b和ADAR融合蛋白實現(xiàn)了定點的RNA編輯，但是由于vector size非常大，很難遞送到體內(nèi)，而且大量表達(dá)外源性的Cas和ADAR有可能產(chǎn)生大量的脫靶甚至癌癥，以及嚴(yán)重的免疫原性。其后Mali實驗室進(jìn)一步證明只過表達(dá)ADAR以及導(dǎo)向RNA也可以實現(xiàn)RNA編輯，雖然vector size問題了，但其他問題還是存在。今年初，Thorsten等開發(fā)了RESTORE，證明了只需要導(dǎo)入化學(xué)修飾的ASO就能實現(xiàn)RNA定點編輯，在之前的基礎(chǔ)上邁出了一大步，但是ASO有效時間相對較短，所以非常有必要開發(fā)出一種長期安全有效的RNA編輯工具。

在最新發(fā)表的Nature Biotechnology中，魏文勝團(tuán)隊解決了上述的問題，非常巧妙的開發(fā)了LEAPER，LEAPER只需要導(dǎo)入改造的短arRNA就能招募內(nèi)源性ADAR發(fā)揮功能。LEAPER不僅高效， 而且極少有脫靶，能在不同類型細(xì)胞中發(fā)揮功能。值得一提的是，LEAPER還可以通過包括化學(xué)合成以及病毒等不同方式遞送，解決了RESCUE的問題。最后魏文勝團(tuán)隊成功的應(yīng)用LEAPER在Hurler綜合征病人原代細(xì)胞中修復(fù)了IDUA活性。這是一項非常令人欣喜的工作，但同時存在一些今后需要解答的問題：LEAPER是否能夠在體內(nèi)也能實現(xiàn)高效的編輯，并且緩解疾病表型？如果過多的內(nèi)源性ADAR被集中招募到目標(biāo)位點，在長時間內(nèi)會不會影響其他位點正常編輯以及功能？

叢樂（斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

北大魏文勝教授課題組在基因編輯領(lǐng)域從DNA編輯開始就一直處在科研最前沿，最新這篇來自他團(tuán)隊的新文章，開創(chuàng)了RNA編輯工具的新可能。更為強(qiáng)大的是，與之前利用CRISPR蛋白-RNA復(fù)合物實現(xiàn)RNA編輯相比，本文描述的Leverageing Endogenous ADAR for Programmable Editing or RNA，即LEAPER技術(shù)，使用了更為簡潔的系統(tǒng)。概括而言，LEAPER技術(shù)將細(xì)胞本身ADAR家族RNA編輯蛋白的活性，通過人工引導(dǎo)ADAR的arRNA（ADAR-recruiting RNA）定位到目標(biāo)RNA分子上，將A堿基編輯為I堿基（I與C實現(xiàn)更強(qiáng)配對從而改變該位置RNA序列）。隨后通過系統(tǒng)的優(yōu)化設(shè)計，不僅確立了arRNA的設(shè)計規(guī)律，還顯著降低了脫靶效應(yīng)，實現(xiàn)精確RNA編輯。

這篇文章的故事相當(dāng)引人入勝，不僅開發(fā)了新技術(shù)，而且文章的出發(fā)點還揭示出之前CRISPR系統(tǒng)RNA編輯的實質(zhì)可能并非我們所想的，不一定主要由CRISPR系統(tǒng)產(chǎn)生，而是源自于細(xì)胞本身ADAR的編輯效應(yīng)。具體來說，作者的第一部分實驗從dCas13-ADAR融合蛋白的RNA編輯系統(tǒng)入手，意外發(fā)現(xiàn)當(dāng)僅在細(xì)胞中表達(dá)crRNA并不加入dCas13系統(tǒng)時，依然可以檢測到RNA編輯，而且這種序列特異的效應(yīng)隨RNA增長而變強(qiáng)。更有趣的是，當(dāng)加入dCas13系統(tǒng)時，可能因為dCas13能夠結(jié)合crRNA從而干擾ADAR結(jié)合，反而會降低編輯效率。因此，作者進(jìn)一步證明不使用crRNA而只使用arRNA也能實現(xiàn)有效RNA編輯。通過敲除ADAR蛋白的對比，文章證明這一活性依賴于內(nèi)源ADAR蛋白。隨后，為將這一技術(shù)應(yīng)用于精確高效的RNA編輯，作者先后完成了arRNA設(shè)計的優(yōu)化（Fig 2），細(xì)胞內(nèi)源基因的多靶點RNA編輯（Fig 3)，并針對全轉(zhuǎn)錄組的特異性進(jìn)行了完善檢測（Fig 4），建立了從設(shè)計規(guī)則到檢測脫靶問題的全面流程。最后文章進(jìn)一步將系統(tǒng)包裝到病毒后實現(xiàn)對多種原代細(xì)胞的RNA編輯，并對與人類疾病相關(guān)的TP53和IDUA基因突變成功進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)RNA編輯修復(fù)，驗證了這一技術(shù)的臨床應(yīng)用潛力。

總結(jié)來說，這篇發(fā)表在Nature Biotechnology的研究長文，從基礎(chǔ)生物學(xué)入手，進(jìn)行了極為創(chuàng)新的技術(shù)開發(fā)、優(yōu)化及其應(yīng)用前景的發(fā)掘。回顧本文的精彩故事，有很多非常值得深入體會和欣賞的要點：（1）嚴(yán)謹(jǐn)完整的實驗設(shè)計極為重要。領(lǐng)域中很多之前的RNA編輯文章會缺少關(guān)鍵的陰性對照，比如很少會做只使用RNA的對照組，只有Cas13蛋白或ntRNA（non-targeting RNA）陰性對照，無法檢測并忽略了很重要的內(nèi)源ADAR編輯效應(yīng)；（2）看到問題后要通過探究背后的生物學(xué)機(jī)理進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新，魏老師的團(tuán)隊并未停留在第一步，他們進(jìn)一步理解內(nèi)源ADAR的RNA編輯以及arRNA的設(shè)計方法，進(jìn)行了一些列優(yōu)化探索，實現(xiàn)對多種人類細(xì)胞和多基因位點的RNA編輯；（3）作為內(nèi)源蛋白RNA編輯的開創(chuàng)性文章之一，本工作的價值還可以延展到后續(xù)更多的研究中，比如是否可以用此技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模文庫篩選（這也是魏文勝教授課題組做出一系列重大貢獻(xiàn)的領(lǐng)域之一）？是否可以進(jìn)一步優(yōu)化和提高這一系統(tǒng)的效率？這些精彩的后續(xù)故事也非常值得我們期待。

原文鏈接:

https://www./articles/s41587-019-0178-z

制版人：小嫻子

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