原文鏈接（https://www./method/Western-Blot-Protocol-Troubleshootings-and-Survey-Results-on-Instruments-and-Reagents.html）

主要內(nèi)容：文章詳細(xì)描述了Western印跡相關(guān)儀器和試劑的比對(duì)結(jié)果，例如ECL發(fā)光信號(hào)檢測(cè)試劑盒，凝膠制劑和預(yù)制凝膠，以及轉(zhuǎn)移膜，數(shù)據(jù)來(lái)源于551個(gè)正式發(fā)表的Western印跡。 文章提供了典型的Western印跡方案，并討論了Western印跡過(guò)程中的常見(jiàn)問(wèn)題。

典型的Western印跡方案：

試劑和緩沖液：

1x RIPA緩沖液：50mMTris，150mMNaCl，0.1%SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，1%Triton X-100或NP40。

1x PBS緩沖液：137mMNaCl，2.7mMKCl，2.7mM Na₂HPO4,2.7mM KH₂PO₄，pH7.4

BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒或Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒

1.5MTris緩沖液（pH8.8）：90.68gTris-HCl至ddH2O，用HCl調(diào)節(jié)pH至8.8至最終500ml

1.0 M Tris緩沖液（pH6.8）：60.58gTris-HCl至ddH2O，用HCl調(diào)節(jié)pH至6.8至最終500ml

10%APS：在1ml ddH2O中的100mgAP。使用前準(zhǔn)備好。

10%SDS：在100ml ddH2O中的10g SDS。

1xTris-甘氨酸緩沖液：25mM Tris，230mM甘氨酸（pH8.3），0.1%SDS。

3xSDS蛋白上樣緩沖液：150mMTris（pH 6.8），6%SDS，30%甘油，30mM EDTA和0.2%溴酚藍(lán)。緩沖液應(yīng)該是新鮮制備，分裝后4℃保存。

1x TTBS：25mMTris（pH 7.5）：0.15MNaCl，0.05%Tween-20,0.001%硫柳汞

1x轉(zhuǎn)移緩沖液：3gTris，14.4g甘氨酸和200ml甲醇，將ddH2O加入1L

樣品制備：

來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)的樣品

貼壁細(xì)胞除去上清液，用1X PBS洗滌，除去殘留的培養(yǎng)基。

加入預(yù)先冷的400ul-1ml 1X RIPA緩沖液/ 100mm培養(yǎng)皿。 在冰上孵育5-10分鐘。

完全刮擦細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到冰上預(yù)先冷卻的1.5ml微管中。

（可選）徹底均化或超聲處理。

在12,000rpm，4℃下離心10-15分鐘，收集上清液備用。

總蛋白應(yīng)儲(chǔ)存在-80°C備用。

組織

組織制備和定量。 將它們切成小塊。

添加約500-600ul預(yù)冷的1x RIPA緩沖液/ 100mg組織。徹底均化組織。在12000rpm，4℃下離心15-20分鐘。

蛋白質(zhì)定量

Bradford測(cè)定和BCA測(cè)定。

SDS-PAGE

聚丙烯酰胺凝膠制劑

在頂部用堆積凝膠（5％）和凝膠梳（10或15個(gè)孔）制備6％-15％的分離凝膠。

樣品加載和電泳將2X SDS蛋白上樣緩沖液與蛋白質(zhì)樣品以1：1的比例徹底混合。

在加載凝膠之前，將樣品在50-60℃預(yù)熱。 預(yù)染色的分子量標(biāo)記物用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)分離和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率。在1X Tris-甘氨酸緩沖液中以60-120V運(yùn)行凝膠1-3小時(shí)。

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF或NC *膜用于抗體檢測(cè)。

在1X轉(zhuǎn)移緩沖液中預(yù)先潤(rùn)濕材料，如凝膠，Whatman紙和海綿。

PVDF膜應(yīng)在甲醇中孵育10s-1min，然后移動(dòng)到1X轉(zhuǎn)移緩沖區(qū)。

堆放材料如下：表殼（黑色邊），海綿，Whatman紙，凝膠，膜，Whatman紙，海綿，表殼（透明面）。放置在黑色面朝黑的轉(zhuǎn)印裝置中。使用冷的1X轉(zhuǎn)移緩沖液在冷卻環(huán)境中轉(zhuǎn)移。 應(yīng)根據(jù)印跡系統(tǒng)制造商的建議優(yōu)化轉(zhuǎn)移電流和時(shí)間。

*切勿將NC膜與甲醇一起孵育。

將溶解在1x TBST中的5%脫脂牛奶中的膜在25℃下封閉1小時(shí)（或在4℃下在振蕩器上過(guò)夜）。與抗體孵育在推薦稀釋度下用1X TBST + 3％BSA稀釋的一抗或根據(jù)結(jié)果優(yōu)化稀釋。在4°C孵育過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間或在室溫下孵育4小時(shí)。

回收第一抗體并在4°C下儲(chǔ)存。 然后在室溫下在振蕩器上將膜洗滌3X 5-10分鐘。

在1X TBST中稀釋第二抗體并將膜在室溫下孵育1小時(shí)或在4℃下在搖床上孵育2-4小時(shí)。在室溫下在振蕩器上在TBST中洗滌3X 10分鐘。

ECL +系統(tǒng)和X射線(xiàn)膠片用于HRP綴合的二抗。

問(wèn)題與解決辦法

1.問(wèn)題：我打算對(duì)擬南芥自噬蛋白中的天然蛋白進(jìn)行Western Blot。目的蛋白質(zhì)和參考基因（Tubulin）同時(shí)檢測(cè)。還是在兩個(gè)不同時(shí)間對(duì)蛋白進(jìn)行印跡，用Tubulin洗滌后再洗滌二次HRP抗體？另外，我想檢測(cè)自噬天然3/4蛋白的表達(dá)，我可以在一個(gè)膜上進(jìn)行所有嗎？

答：您不應(yīng)該嘗試同時(shí)檢測(cè)所有蛋白質(zhì)。在使用第二種一抗之前，您應(yīng)該去除一抗和二抗。即，用針對(duì)您感興趣的蛋白質(zhì)的第一抗體和第二抗體進(jìn)行印跡，用ECL檢測(cè)，然后用剝離緩沖液剝離一抗和二抗，然后用微管蛋白抗體及其二抗進(jìn)行印跡，并檢測(cè)。在剝離過(guò)程中，PVDF膜通常比硝酸纖維素膜更好地保留蛋白質(zhì)。 PVDF膜的供應(yīng)商應(yīng)為您提供有關(guān)剝離緩沖液（溫和或苛刻）和方案的信息。您應(yīng)該能夠執(zhí)行幾次印跡/剝離循環(huán)（一般最多三次）。每次在印跡之前，您可以使用Ponseau S染色檢查印跡，以便在您不確定時(shí)可視化樣品蛋白質(zhì)。請(qǐng)注意，由于剝離，印跡上的樣品蛋白會(huì)丟失。

沒(méi)有信號(hào)，可能的原因：

用于檢測(cè)的錯(cuò)二抗。 （確保一抗的宿主）

低濃度的一抗/二抗。 （提高濃度再試一次）

一抗不識(shí)別被檢測(cè)物種中的蛋白質(zhì)。（檢查一抗的特異性）

加在凝膠上的蛋白質(zhì)量太少。 （增加樣本量）

轉(zhuǎn)移效率很低。 （修改轉(zhuǎn)移程序的操作。確保PVDF與甲醇預(yù)孵育。轉(zhuǎn)移后干燥PVDF以確保蛋白質(zhì)與疏水膜的結(jié)合）

一抗已被使用過(guò)多次。 （使用新稀釋的一抗）

阻塞時(shí)間太長(zhǎng)或洗太多次。 （減少堵塞時(shí)間和洗滌時(shí)間）

檢測(cè)套件不起作用。 （使用陽(yáng)性對(duì)照并確保檢測(cè)試劑盒正常工作）

疊氮化鈉可以抑制二抗。 （避免在稀釋緩沖液中使用疊氮化鈉）

與一抗或二抗的孵育時(shí)間太短。 （延長(zhǎng)孵化時(shí)間）

SDS加載緩沖區(qū)可能已過(guò)期。 （使用新制備的SDS上樣緩沖液）

SDS上樣緩沖液和樣品裂解液混合均勻。 （劇烈渦旋）

高背景：

阻塞時(shí)間太短或使用阻塞緩沖液錯(cuò)誤（延長(zhǎng)阻斷時(shí)間或用BSA替代脫脂牛奶，或制作鮮奶溶液）。使用BSA，脫脂脫脂乳，偶爾使用來(lái)自山羊或兔等的全血清來(lái)預(yù)孵育膜，以使膜上的任何非特異性結(jié)合空間飽和。一旦非特異性結(jié)合空間飽和，第一抗體將僅結(jié)合特異性抗原。 BSA含有一種蛋白質(zhì)，白蛋白。牛奶含有數(shù)百種蛋白質(zhì)，酪蛋白是其主要成分，因此可以阻斷所有潛在的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。因此，牛奶優(yōu)于BSA，也更便宜。大多數(shù)一抗不太可能與白蛋白或酪蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。如果任何沒(méi)有蛋白質(zhì)的區(qū)域具有高背景，則阻塞步驟可能無(wú)法正常工作。

高濃度的一抗/二抗。 （降低抗體濃度）

洗滌不足。 （增加洗滌次數(shù)）

孵化溫度太高。 （確保一抗在4°C孵育）

錯(cuò)誤的膜或膜干燥了一段時(shí)間。 （防止膜干燥）

較高分子量的高背景可能表明還原劑/ SDS /樣品加熱未正確完成。

非特異性信號(hào)

高濃度的一抗/二抗。 （降低抗體濃度）

內(nèi)源性免疫球蛋白，特別是在組織裂解液中[2]。如果沒(méi)有一抗的對(duì)照運(yùn)行，該信號(hào)應(yīng)該持續(xù)。用例如蛋白G瓊脂糖預(yù)先清除內(nèi)源性免疫球蛋白，使用專(zhuān)門(mén)的二抗如TruBlot，或加熱等其他治療可以幫助減少來(lái)自?xún)?nèi)源性免疫球蛋白的非特異性信號(hào)[2]。

臟兮兮或模糊的樂(lè)隊(duì)

凝膠的平衡時(shí)間不足或凝膠與膜之間的接觸不均勻。 （確保凝膠沒(méi)問(wèn)題并改善轉(zhuǎn)移程序）

禿頭斑點(diǎn)

凝膠和膜之間的氣泡。 （確保凝膠和膜之間沒(méi)有氣泡）

帶尺寸與理論重量不一致

抗體特異性差。 （改變一抗）

一些蛋白質(zhì)的遷移可能與其理論重量完全不同。

未能揭示可能的翻譯后修改

通過(guò)SDS-PAGE無(wú)法解析向蛋白質(zhì)分子引入負(fù)電荷的翻譯后修飾，如聚（ADP-核糖基 - PAR鏈）[3]。然而，它們可以通過(guò)CTAB-PAGE分離揭示[3]。 CTAB，西曲溴銨（（C16H33）N（CH3）3Br，十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基三甲基溴化銨）是胺類(lèi)陽(yáng)離子季銨表面活性劑。

溴化一銨（monium bromide），是一種胺基陽(yáng)離子季銨鹽表面活性劑。

Labome對(duì)Western blot相關(guān)儀器和試劑的調(diào)查

Labome調(diào)查文獻(xiàn)以了解試劑和儀器的常見(jiàn)用法。

信號(hào)檢測(cè)

化學(xué)發(fā)光是Western印跡中常用的信號(hào)檢測(cè)方法。表1列出了主要供應(yīng)商及其主要品牌，以及Labome調(diào)查的正式出版物中的引用次數(shù)。 GE Healthcare及其各種Amersham ECL試劑盒和Thermo Fisher Pierce SuperSignal West試劑盒主導(dǎo)了這種Western印跡試劑的提供。 GE Healthcare Amersham ECL試劑（Plus最常被引用。注意：自2014年10月4日起，GE醫(yī)療集團(tuán)已停止使用Plus;當(dāng)前版本為Prime）用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4] ，Vav2和Vav3在皮膚癌中的作用[5]，白藜蘆醇對(duì)肌肉中線(xiàn)粒體生物合成的影響[6]，Erf2在蛋白質(zhì)棕櫚?；械恼{(diào)節(jié)作用和粟酒裂殖酵母的減數(shù)分裂[7]，sFLT-的作用1維持小鼠模型中的無(wú)血管光感受器層[8]，α-突觸核蛋白在突觸囊泡模擬聚類(lèi)中的作用[9]，信息素配體[10]，FGF21在延長(zhǎng)小鼠壽命中的作用[11] ]，在脊索動(dòng)物胚胎中建立尖銳的邊界[12]，以及轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)節(jié)[13]。截至2014年10月，GE Healthcare提供三種版本的ECL套件：常規(guī)ECL，Prime和Select，基于敏感性和信號(hào)持續(xù)時(shí)間。圖1列出了GE Healthecare的選擇指南。

預(yù)制凝膠

SDS-PAGE中使用的凝膠可以由丙烯酰胺和其他化學(xué)品新鮮制成，或者可以使用來(lái)自商業(yè)供應(yīng)商的預(yù)制凝膠。 Life Tech和Bio-Rad是預(yù)制凝膠的兩個(gè)主要供應(yīng)商（表2）。 Life Technologies NuPAGE Novex Bis-Tris預(yù)制凝膠（大多數(shù)為4-12％）用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4]等[14,24]。 Life Technologies NuPAGE Novex 3-8％Tris-醋酸酯凝膠用于研究果蠅中CK2激酶的功能特性[4]和Wnt /β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)端粒酶的調(diào)節(jié)[25]。 為了研究caveolar coat complex的結(jié)構(gòu)組成，采用了Invitrogen公司的NuPAGE 4-20％Tris / Glycine gel進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)[24]。 Bio-Rad 4-15％SDS-PAGE凝膠（目錄號(hào)5671084）用于研究連接[26]。

原創(chuàng)： 走心科研小助手