1．pIII展示系統(tǒng)及噬苗體抗體
　　絲狀噬茵體是單鏈DNA病毒，pIII是病毒的次要外圍蛋白(minor coatprotein)、位于病毒顆粒的一端，每個(gè)病毒顆粒都有3—5個(gè)拷貝pIII蛋白，pIII有兩個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插進(jìn)，即N端和近N端可伸屈胃內(nèi)。當(dāng)抗體片斷或蛋白質(zhì)融合到PIII的N端時(shí)，噬菌體仍有感染性，但若融合到后一位點(diǎn)則會(huì)切往N端而喪失感染性，這時(shí)就需有輔助噬菌體提供野生型pIII蛋白。PIII很輕易為蛋白水解酶水解。所以有輔助噬菌體超感染時(shí)．可以使每個(gè)噬菌體均勻顯示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬茵體，從而使抗體部分最大限度地保持原構(gòu)型而功能完好。
  PIII展示系統(tǒng)的主要用途是制備噬茵體抗體，它的突出優(yōu)點(diǎn)是模擬了自然免疫選擇系統(tǒng)。自然免疫系統(tǒng)中．抗原結(jié)合于B細(xì)胞表面受體而使其活化并分裂增殖、分化成有抗體分泌功能的漿細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程可以從約5×10⁹個(gè)鼠細(xì)胞選出一個(gè)至幾個(gè)特異B細(xì)胞，并有選擇性地富集特異性B細(xì)胞，通過(guò)多輪突變和選擇使抗體親和力成熟。pIII展示系統(tǒng)完全模擬了自然選擇系統(tǒng)；噬菌體展示的抗體片斷可以由抗原包被的板、柱等選擇，或者用生物素標(biāo)記的抗原從液相中捕捉。結(jié)合在固相抗原的噬茵體抗體經(jīng)洗滌后可用可溶性半抗原、酸、堿等洗脫，然后感染大腸桿菌培養(yǎng)擴(kuò)增，再經(jīng)下一輪的“吸附—洗脫—擴(kuò)增”篩選。首輪篩選可使特異性噬菌體富集20一1000倍，一般經(jīng)4輪篩選，可富集107倍。對(duì)初步篩選的抗體，可以用錯(cuò)構(gòu)酶及PCR鍺配技術(shù)等實(shí)行多輪突變或采用鏈置換法使其親和力成熟。
   用PIII系統(tǒng)制備抗體的基本程序是：從經(jīng)免疫或未免疫者獲取淋巴細(xì)胞(外周血淋巴細(xì)胞，或脾、淋巴結(jié)、骨髓等的淋巴細(xì)肥)，提取細(xì)胞mRNA(或細(xì)胞基因組DNA)，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用PCR方法擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈基因，若制備ScFv抗體片斷，還需設(shè)計(jì)接頭Linker，如（Gly4—Ser），做成VH—Linker—VL連接)。將擴(kuò)增的抗體基因克隆到絲狀噬茵體載體中，若欲制備ScFv抗體，則克隆VH—Linker—VL基因，若制備Fab抗體、則可將VHCHl基因克隆進(jìn)λ菌體載體，輕鏈基因克隆進(jìn)PASK22類(lèi)型載體中，在大腸桿菌共表達(dá)，或?qū)⒍呖寺∵M(jìn)同一噬茵體載體中進(jìn)行表達(dá)。P III展示系統(tǒng)的載體，在抗體基因與P III蛋白之間插進(jìn)了一個(gè)琥珀中止密碼(amber stop codon)，當(dāng)此密碼受抑制時(shí)抗體片斷就展示在噬菌體表面，當(dāng)此密碼不受抑制時(shí)抗體則分泌。因此在抑制型和非抑制型大腸桿菌中培養(yǎng)重組噬菌體時(shí)就分別模擬了B細(xì)胞表面呈現(xiàn)抗體SmIg和漿細(xì)胞分泌抗體的功能。已有用P III展示系統(tǒng)成功地篩選到高親和力特異性抗體的報(bào)道。
　　與雜交瘤技術(shù)相比，pIII展示系統(tǒng)篩選范圍從幾千擴(kuò)增到幾百萬(wàn)甚至幾億．而時(shí)間可以從幾個(gè)月縮短到幾周，它不但繞過(guò)了繁瑣的雜交瘤技術(shù)．甚至可以繞過(guò)免疫，而且可以直接獲取人源性抗體，解決了鼠單抗應(yīng)用于人體免疫源性題目。
2．pVIII及其它展示系統(tǒng)
pVIII是絲狀噬茵體主要衣殼蛋白(major Coat protein)，每個(gè)病毒顆粒有3000拷貝pVIII蛋白。pVIII的N端四周可融合五或六肽，但不能融合更長(zhǎng)的肽鏈，由于較大的多聚蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失往感染力。但有輔助噬茵體參與時(shí)，可提供野生型pVIII蛋白．降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片斷。

1.pV展示系統(tǒng)
　　λ噬菌體的主要尾部蛋白pV可供外源序列插進(jìn)。λ噬菌體基因V編碼的主要尾部蛋白形成管狀結(jié)構(gòu)，由32個(gè)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤(pán)狀結(jié)構(gòu)又由6個(gè)pV亞單位組成。pV有兩個(gè)折疊區(qū)〔fo1ding domain)，C真?zhèn)€折疊區(qū)是病毒的非功能區(qū)，可供外源序列插進(jìn)或替換。Maruyama等用pV系統(tǒng)成功地展示了有活性的大分子蛋白：β—半乳糖苷酸(465KD)和植物外源凝集素BPA(120KD)。DNA結(jié)合蛋白、放多細(xì)胞質(zhì)蛋白若融合進(jìn)絲狀噬菌體，將相互干擾由細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)到周質(zhì)腔分泌的通道，而用λ噬菌體使其在細(xì)胞質(zhì)中完成折疊，無(wú)需分泌，因此避免了這一干擾。λ噬菌體還可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)，因此可作為絲狀噬菌體展示系統(tǒng)的補(bǔ)充。
2．D蛋白展示系統(tǒng)。
　　D蛋白是λ噬菌體頭部組裝必須蛋白，分子量11KD。λ噬茵體顆粒的兩個(gè)結(jié)構(gòu)單位頭部和尾部是分別組裝的。在頭部組裝過(guò)程中先形成支架狀前頭，然后水解加工成前頭，當(dāng)DNA進(jìn)人頭部以后，D蛋白附著于病毒衣殼的外側(cè)、將噬茵體頭部鎖住，使之圍繞DNA就位，因此正常情況下，D蛋白在噬茵體頭部形態(tài)發(fā)生上是必須的。但是當(dāng)噬茵體基因組小于野生型基因組的82％時(shí)，它可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體。這種展示一般為N端展示。它的組裝可以在體內(nèi)，也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD—噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)λD—溶源的E．Coli菌株中從而補(bǔ)償溶源茵所缺的D蛋白，通過(guò)熱誘導(dǎo)而被組裝，或利用噬菌體P1的Cre—loxP定點(diǎn)重組系統(tǒng)將外源基因整合進(jìn)進(jìn)噬茵體基因組中。
　　D蛋白展示系統(tǒng)的特點(diǎn)：由于是在病毒細(xì)胞內(nèi)完成組裝．無(wú)需將外源肽或蛋白分泌到細(xì)菌細(xì)胞膜，可以展示對(duì)細(xì)胞有毒性的蛋白。另外，D蛋白展示系統(tǒng)還可以用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，抗原位點(diǎn)分析及作為基甲輸送工具。Mikawa等對(duì)D蛋白的基因進(jìn)行了改造，使外源序列在D蛋白的N端和C端都能插進(jìn)，并成功地表面展示了有活性的葡萄球菌A蛋白IgG結(jié)合域、β—半乳糖昔酶和β—內(nèi)酰胺酶。

  T4噬菌體展示系統(tǒng)是將外源肽或蛋白質(zhì)與T4噬菌體的小外衣殼蛋白(small outer capsid protein SOC)C端融合而被展示。如SOC是一個(gè)分子量為9KD的小蛋白，是T4衣殼組裝非必須的，而且不論在體內(nèi)還是體外，它都具有與成熟衣殼表面特定位點(diǎn)高親和力地專(zhuān)一結(jié)合的能力，T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)組裝而不必通過(guò)分泌途徑，因此可以展示的敗或蛋白質(zhì)范圍廣，尤其適用于展示那些不能被E．coli分泌的復(fù)雜蛋白質(zhì)。
　　目前已成功地利用該系統(tǒng)展示了HIV—1病毒被膜糖蛋白gpl 20的v3環(huán)狀結(jié)構(gòu)域和脊髓灰質(zhì)炎病毒VPl衣完蛋白(312肽)，兩者均能形成正確的折疊結(jié)構(gòu)。由于該系統(tǒng)容量大(至少35KD的蛋白質(zhì))、拷貝數(shù)高，故在完整結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的免疫學(xué)展示、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)問(wèn)相互作用的研究及生物工程學(xué)方面有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。
　　現(xiàn)在有研究報(bào)道利用E.coli的脂蛋白、鞭毛蛋白展示外源蛋白。但是相對(duì)而言，革蘭氏陽(yáng)性菌比陰性的有優(yōu)越性：G 細(xì)菌表面受體比G—細(xì)菌更易接受外源序列的插進(jìn)；G—細(xì)菌展示系統(tǒng)的表面展示要穿過(guò)整個(gè)細(xì)胞質(zhì)膜，需要膜上的正確整合過(guò)程，而G 細(xì)菌展示系統(tǒng)只需穿過(guò)單層膜就可以實(shí)現(xiàn)理想的展示；以細(xì)菌全細(xì)胞作為診斷或Panning實(shí)驗(yàn)，從巨大文庫(kù)中篩選特異性細(xì)菌克隆的實(shí)際操縱中，由于G 細(xì)菌有較厚的細(xì)胞壁，不輕易在各種實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生細(xì)胞溶解。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)