一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要素和原則

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)就是擬定實(shí)驗(yàn)方案，在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)，對(duì)研究方案作合理的安排，以減少隨機(jī)誤差的影響。采用適當(dāng)?shù)难芯繉?shí)驗(yàn)次數(shù)，減少實(shí)驗(yàn)的成本并能對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析，提高實(shí)驗(yàn)研究的可靠性，從而實(shí)現(xiàn)研究的目的。

研究設(shè)計(jì)包括專業(yè)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)兩個(gè)部分。統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)主要是依據(jù)研究目的，從研究的現(xiàn)況條件出發(fā)，規(guī)定研究因素、選擇效應(yīng)指標(biāo)、確定研究對(duì)象的引入方式方法和規(guī)模，擬實(shí)施的方法、方案，及數(shù)據(jù)收集、整理分析的模式，直至結(jié)果的解釋，進(jìn)行系統(tǒng)的安排，使其消耗最少的人力物力和時(shí)間，而獲得可靠的信息與結(jié)論。

1．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要素

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要素為：實(shí)驗(yàn)單位、處理因素和實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。

(1)大多數(shù)情況下，實(shí)驗(yàn)單位等同于實(shí)驗(yàn)對(duì)象、受試對(duì)象，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物即為實(shí)驗(yàn)單位。

(2)處理要素：是研究者根據(jù)研究目的施加于實(shí)驗(yàn)單位，在實(shí)驗(yàn)中需要觀察并闡明其效應(yīng)的因素，是實(shí)驗(yàn)單位分組的標(biāo)志。而非處理因素則是指實(shí)驗(yàn)中非人為施加的、與處理因素同時(shí)存在，同樣可以使受試對(duì)象產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的因素，如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的雌雄、體重等因素。突出研究因素的主導(dǎo)作用，排除混雜因素的干擾作用，可以通過(guò)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，盡量使非處理因素在各處理組中的分布達(dá)到一致或均衡，以便分離出處理因素的效應(yīng)。另外，處理因素的施加方法、強(qiáng)度、頻率和持續(xù)時(shí)間等，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)始終保持不變，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)的可靠性和穩(wěn)定性；處理因素作用于受試對(duì)象的反應(yīng)，是研究結(jié)果的最終體現(xiàn)，其基本要求客觀性、特異性、靈敏性和精確性。

(3)實(shí)驗(yàn)效應(yīng)：處理因素作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)效應(yīng)，一般是用各種指標(biāo)來(lái)反映的。指標(biāo)按其性質(zhì)可分為計(jì)數(shù)(含等級(jí))指標(biāo)和計(jì)量指標(biāo)，計(jì)數(shù)指標(biāo)如“是”“否”“有”“無(wú)”，“陽(yáng)性”“陰性”，“痊愈”“顯效”“好轉(zhuǎn)”“無(wú)效”，“存活”“死亡”等。計(jì)量指標(biāo)指可測(cè)量(含間接測(cè)量)的指標(biāo)，如很多檢查和檢驗(yàn)指標(biāo)。

在對(duì)指標(biāo)進(jìn)行觀察時(shí)應(yīng)注意：

①實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的觀察應(yīng)避免偏性。研究者的心理往往偏于陽(yáng)性結(jié)果，為了消除或減少測(cè)量偏差，設(shè)計(jì)時(shí)常采用盲法。

②應(yīng)注意處理和效應(yīng)的關(guān)系：處理與效應(yīng)之間存在一定的關(guān)系，如劑量反應(yīng)曲線。做實(shí)驗(yàn)應(yīng)選擇一個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)劑量。

2．實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三大原則即為重復(fù)(replication)、隨機(jī)化(randomization)和對(duì)照(control)，這是藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本要求。其目的是排除非處理因素的作用，控制隨機(jī)誤差，避免系統(tǒng)誤差，提高實(shí)驗(yàn)效率。

(1)重復(fù)原則(重復(fù)穩(wěn)定性)：能夠充分重現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)，才能稱為可靠的實(shí)驗(yàn)。另外，實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)有一定數(shù)量的重復(fù)觀測(cè)結(jié)果，即實(shí)驗(yàn)單位要達(dá)到一定數(shù)量。避免將個(gè)別情況誤認(rèn)為普遍情況，將偶然誤認(rèn)為必然，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果錯(cuò)誤推廣，同一實(shí)驗(yàn)條件下、同一觀測(cè)指標(biāo)的多次測(cè)量會(huì)有變異，多次測(cè)量才能描述變異，估計(jì)隨機(jī)誤差。實(shí)驗(yàn)單位足夠多時(shí)，才能獲得隨機(jī)誤差比較小的統(tǒng)計(jì)量。重復(fù)的目的是估計(jì)和控制實(shí)驗(yàn)中的隨機(jī)誤差，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。樣本中包含的實(shí)驗(yàn)單位數(shù)稱為樣本含量(樣本量)。重復(fù)原則的應(yīng)用就是樣本含量的估計(jì)。

首先要考慮實(shí)驗(yàn)要有足夠的例數(shù)，能準(zhǔn)確重復(fù)再現(xiàn)，同時(shí)盡可能排除對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾，它包括：①動(dòng)物方面，如品種、品系、體重、年齡、性別、飼料及飼養(yǎng)環(huán)境等；②儀器方面：準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、電壓穩(wěn)定性及操作熟練程度等；③藥物方面：性能、批號(hào)、純度、劑量和注射速度等。此外還有室溫、氣壓、季節(jié)等物理因素，甚至實(shí)驗(yàn)是在上午還是下午，動(dòng)物群養(yǎng)或單養(yǎng)等，均應(yīng)預(yù)先考慮清楚，做好設(shè)計(jì)。

(2)隨機(jī)化原則：其目的是一切干擾因素分配到各組時(shí)只受純機(jī)遇的抽樣誤差的影響，避免受實(shí)驗(yàn)者主觀因素的干擾，減小或避免偏性誤差，是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的重要原則之一。隨機(jī)化手段可采取隨機(jī)數(shù)字表或小計(jì)算機(jī)上的隨機(jī)數(shù)字鍵。

在實(shí)驗(yàn)分組時(shí)，每個(gè)受試對(duì)象均有相同的概率或機(jī)會(huì)被分配到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。隨機(jī)化是一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組程序，而非“隨便”、“隨意”和“非選擇性”。隨機(jī)化的意義是保證各種非處理因素在各個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組達(dá)到均衡，從而顯現(xiàn)處理因素的作用，避免各種主、客觀因素可能導(dǎo)致的偏性，減少系統(tǒng)誤差，提高研究結(jié)果的效度。隨機(jī)化分組是從假設(shè)檢驗(yàn)結(jié)果推論因果關(guān)系的基礎(chǔ)，確定處理因素與實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間因果關(guān)系的前提是隨機(jī)分組后、施加干預(yù)前，所有觀察對(duì)象都屬于同一個(gè)總體。

(3)對(duì)照原則：確定實(shí)驗(yàn)組時(shí)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，即不施加處理因素的實(shí)驗(yàn)組，只暴露于非處理因素。對(duì)照組除沒(méi)有處理因素外，其他對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能有影響的因素(已知、可控的非處理因素)都應(yīng)該與實(shí)驗(yàn)組盡量相同。

常用的對(duì)照形式，分為空白對(duì)照(blank control)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照(experimental control)、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(standard control)、相互對(duì)照(mutual control)、潛在對(duì)照(potential control)?？瞻讓?duì)照即對(duì)對(duì)照組不施加干預(yù)，對(duì)照組的處理因素為“空白”；實(shí)驗(yàn)對(duì)照即對(duì)照組不施加干預(yù)，但施加某種與處理因素有關(guān)的實(shí)驗(yàn)因素，用于處理因素的施加需伴隨其他因素，而這些因素又可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)；標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組的干預(yù)采用現(xiàn)有“標(biāo)準(zhǔn)”方法或常規(guī)方法，主要用于臨床試驗(yàn)，當(dāng)倫理上不允許對(duì)對(duì)照組患者采用空白對(duì)照或假干預(yù)，如新藥研究采用目前療效確定的藥物作為對(duì)照藥；相互對(duì)照則不專門(mén)設(shè)立對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組間互為對(duì)照，如比較幾種同類藥物的療效差別：潛在對(duì)照也不用專門(mén)設(shè)立對(duì)照組，以過(guò)去的研究結(jié)果為對(duì)照(歷史對(duì)照)。另外，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組例數(shù)相等時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)證明其統(tǒng)計(jì)效率最高，輕視對(duì)照或?qū)φ蛰^少是錯(cuò)誤的和不妥當(dāng)?shù)摹?/span>

二、抽樣和分組

抽樣和分組必須嚴(yán)格遵守隨機(jī)原則，主要因素要均衡一致，但抽取哪一只動(dòng)物。分配到哪一組則按隨機(jī)數(shù)字表或鍵而定。如果隨意拿取動(dòng)物，先取到的為第一組，依次遞推，則反應(yīng)活潑敏捷不易抓到的動(dòng)物勢(shì)必集中到最后幾組，各組的條件就有了偏性誤差。為此，下面介紹幾種主要的分組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

1．完全隨機(jī)設(shè)計(jì)

完全隨機(jī)設(shè)計(jì)(completely random design)亦稱單因素設(shè)計(jì)，即將受試對(duì)象隨機(jī)分到各處理組中進(jìn)行試驗(yàn)觀察，或分別從不同總體中隨機(jī)抽樣進(jìn)行對(duì)比觀察。它適用于兩個(gè)或兩個(gè)以上樣本的比較，各組間樣本量可相等，也可不相等，但是樣本相等時(shí)統(tǒng)計(jì)分析效率較高。

例1．將12只動(dòng)物隨機(jī)分配到A、B兩組。

(1)先將12只動(dòng)物編號(hào)為1、2……12號(hào)，然后在隨機(jī)數(shù)字表內(nèi)任意確定一個(gè)起始點(diǎn)和方向連續(xù)取12個(gè)隨機(jī)數(shù)字，并依次抄錄于動(dòng)物編號(hào)下。

(2)本例從隨機(jī)數(shù)字表第6行第19、20列起向下讀取12個(gè)隨機(jī)數(shù)字，取兩位隨機(jī)數(shù)字(表4-1)。

(3)將隨機(jī)數(shù)字從小到大順序排列后得序號(hào)R，并規(guī)定R=1～6者為A組，R：7～12者為B組。

表4-1  12只動(dòng)物完全隨機(jī)分兩組結(jié)果（采用隨機(jī)數(shù)字表）

例2．將15只動(dòng)物隨機(jī)分成三組。

(1)將動(dòng)物編號(hào)如1、2……15號(hào)，然后在隨機(jī)數(shù)字表內(nèi)從某行某列起向某方向讀取15個(gè)隨機(jī)數(shù)字，取兩位隨機(jī)數(shù)字，依次抄錄于動(dòng)物編號(hào)下。

(2)將隨機(jī)數(shù)字從小到大順序排列后得序號(hào)R。

(3)規(guī)定R=1～5者為A組，R=6～10者為B組，R=11～15者為C組。

(4)本例從隨機(jī)數(shù)字表第5行第17、18列起向下讀取15個(gè)隨機(jī)數(shù)字(表4-2)。

表4-2  15只動(dòng)物完全隨機(jī)分三組結(jié)果

注：隨機(jī)數(shù)字06之后隨機(jī)數(shù)字為02，但前面已經(jīng)出現(xiàn)過(guò)，故舍去。

隨機(jī)分組應(yīng)注意：

(1)隨機(jī)數(shù)的位數(shù)不應(yīng)小于N的位數(shù)：

(2)隨機(jī)數(shù)如果有重號(hào)數(shù)字應(yīng)舍棄：

(3)若科研上需要各組例數(shù)不等可利用序號(hào)(R)調(diào)整各組例數(shù)。如在例2中要求A組6例，B組5例，C組4例，可規(guī)定R=1～6者為A組，R=7～11者為B組，R＝12～15者為C組。

統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)方法：

(1)計(jì)量資料：t檢驗(yàn)、方差分析或秩和檢驗(yàn)等；

(2)計(jì)數(shù)資料：卡方檢驗(yàn)等。

完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的優(yōu)缺點(diǎn)：設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析簡(jiǎn)單。但是，實(shí)驗(yàn)效率不高，只能分析單因素。

2．配對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將受試對(duì)象按某些特征或條件配成對(duì)子，然后分別把每對(duì)中的兩個(gè)受試對(duì)象隨機(jī)分配到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，再給予每對(duì)中的個(gè)體以不同處理，連續(xù)實(shí)驗(yàn)若干對(duì)，觀察對(duì)子間的差別有無(wú)意義。

配對(duì)設(shè)計(jì)的特征或條件：

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常以種屬、品系、性別相同，年齡、體重相近的兩只動(dòng)物配成對(duì)子；臨床療效觀察常將病種、病型、族別、性別相同，年齡相差不超過(guò)2～3歲，生活習(xí)慣、工作環(huán)境等相似的患者配成對(duì)子；進(jìn)行配對(duì)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)注意不要“配對(duì)過(guò)頭”。例如，研究高血壓與鈉鹽攝入量的關(guān)系，如果將高血壓患者與非高血壓患者按飲食習(xí)慣配對(duì)后比較鈉鹽攝入量，由于飲食習(xí)慣與鈉鹽攝入量關(guān)系密切，可能會(huì)掩蓋病例與對(duì)照在鈉鹽攝入量上的差異；實(shí)驗(yàn)者必須在整個(gè)研究過(guò)程中，始終能辨認(rèn)屬于同一對(duì)子的是哪兩只動(dòng)物，因此動(dòng)物編號(hào)是非常重要的；記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)保持每對(duì)的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，不能錯(cuò)亂或缺失。計(jì)算每對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差值時(shí)，順序應(yīng)當(dāng)一致。

例：取20只小鼠，按性別、體重、窩別配成10對(duì)，試將其分配到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中去。

先按配對(duì)條件配對(duì)，并將對(duì)子編號(hào)，如1.1、1.2、2.1、2.2……10.1、10.2，然后再在隨機(jī)數(shù)字表上任意指定行列及查找方向，將隨機(jī)數(shù)字依次抄寫(xiě)在“對(duì)子號(hào)”下。

事先規(guī)定，遇單數(shù)定為AB順序，遇雙數(shù)定為BA順序。

本例：從隨機(jī)數(shù)字表中第46行31、32列向右查找隨機(jī)數(shù)字(表4～3)

表4-3  20只動(dòng)物完全隨機(jī)分三組結(jié)果

常用統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)方法

計(jì)量資料：配對(duì)t檢驗(yàn)、配對(duì)符號(hào)檢驗(yàn)、wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。

計(jì)數(shù)資料：卡方檢驗(yàn)、一致性檢驗(yàn)等。

配對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)：配對(duì)設(shè)計(jì)可做到嚴(yán)格控制非處理因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)使受試對(duì)象間的均衡性增大，因而可提高實(shí)驗(yàn)效率。它與成組的完全隨機(jī)設(shè)計(jì)相比較，可克服受試對(duì)象間由于遺傳因素的差異所引起的偏差，同時(shí)還可以減少樣本含量。

3．交叉實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(以藥理實(shí)驗(yàn)為例)

是在自身配對(duì)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上發(fā)展的雙因素設(shè)計(jì)，可在同一對(duì)象身上觀察兩種處理的效應(yīng)，并能減少誤差，提高檢驗(yàn)效率。

例如：研究A藥治療高血壓的療效，以傳統(tǒng)的抗高血壓B藥物作對(duì)照。經(jīng)隨機(jī)化將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，一組先給A藥后再給B藥，另一組先給B藥后再給A藥。第一、二階段均為一個(gè)月，一、二階段之間的間歇期為一周。結(jié)果見(jiàn)表4-4：

表4-4  兩種藥物治療高血壓的交叉實(shí)驗(yàn)

4．析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)(factorial design)

析因設(shè)計(jì)是一種多因素多水平交叉分組進(jìn)行全面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方法，將兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的各水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

例如：2個(gè)因素同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素取2個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)的總組合數(shù)有2²=4個(gè)(表4-5)；如果每個(gè)因素取3個(gè)水平，則總組合數(shù)有3²=9個(gè)，即這9種組合都要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，故一般采用簡(jiǎn)單的析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)。

析因設(shè)計(jì)可以提供三方面的重要信息：各因素不同水平的效應(yīng)大小；各因素間的

表4-5 2×2析因設(shè)計(jì)

交互作用；通過(guò)比較各種組合，找出最佳組合。如果在一次實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)一個(gè)因素的水平間的效應(yīng)隨其他因素的水平不同而變化時(shí)，因素間存在交互作用，它是各因素效應(yīng)間不獨(dú)立的表現(xiàn)。

5．正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交設(shè)計(jì)適用于多因素分析，可算出各因素不同水平對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，找出最佳組合。現(xiàn)以L₄(2³)及L9(3⁴)正交設(shè)計(jì)結(jié)合例子簡(jiǎn)單介紹(L表示正交設(shè)計(jì)，4或9表示分4組或9組，2³表示3個(gè)因素2個(gè)水平，3⁴表示4個(gè)因素3個(gè)水平)。

例1  營(yíng)養(yǎng)液中有三個(gè)因素(Ca²⁺，K⁺，Mg²⁺)，各有2個(gè)水平(高濃度、低濃度)，要分析它們對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，找出最佳組合，可設(shè)計(jì)如下表4-6：

表4-6 L4(23)正交設(shè)計(jì)

表中Ca²⁺的1水平之和為8.6+6.2=14.8，K⁺的1水平之和為8.6+9.7=18.3…?？梢钥闯?，Ca²⁺的差值絕對(duì)值最大，說(shuō)明Ca²⁺對(duì)實(shí)驗(yàn)影響最大，且低濃度好。K⁺的影響次之，高濃度好。Mg²⁺的影響最小，高濃度好。結(jié)論是以低Ca²⁺，高K⁺，高M(jìn)g²⁺為最佳組合。但是，這一組合在實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)，但正交設(shè)計(jì)提示這是最佳組合，可安排復(fù)試加以驗(yàn)證。

例2  四種藥物各有三個(gè)水平，用L₉(3⁴)正交設(shè)計(jì)，見(jiàn)表4-7：

由表中可以看出甲藥影響最大，應(yīng)列為主藥，大劑量較好。乙、丙、丁三藥影響較小，可列為輔藥，最佳組合為甲藥大劑量，乙藥大劑量，丙藥小劑量，不用丁藥。按理四種藥物各三個(gè)水平，應(yīng)做3⁴=81組實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在只做9組就找出了實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)的最佳組合。

三、預(yù)試驗(yàn)及篩選

1．預(yù)試驗(yàn)

在正式實(shí)驗(yàn)前應(yīng)充分重視預(yù)試驗(yàn)的重要性，小規(guī)模的預(yù)試驗(yàn)是使用少量的動(dòng)物得到預(yù)示性的數(shù)據(jù)或通過(guò)預(yù)試驗(yàn)將操作和技術(shù)固定并完善，即通過(guò)預(yù)試驗(yàn)可了解各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，找出最適實(shí)驗(yàn)對(duì)象、用藥劑量和實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)指標(biāo)，如溫度、刺激強(qiáng)度、營(yíng)養(yǎng)液組方等，為正式實(shí)驗(yàn)做必要的準(zhǔn)備，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)穩(wěn)定性和靈敏度。為此，預(yù)試驗(yàn)中應(yīng)注意以下問(wèn)題：

表4-7  L₉(3⁴)正交設(shè)計(jì)

(1)實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性：變異系數(shù)越小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)波動(dòng)越小，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)穩(wěn)定性越好。變異系數(shù)CV=。

(2)實(shí)驗(yàn)靈敏度：預(yù)試驗(yàn)時(shí)測(cè)定兩個(gè)有效量(D1、D2)，測(cè)定其反應(yīng)強(qiáng)度(E1、E2)。

計(jì)算因變系數(shù)，因變系數(shù)越小，實(shí)驗(yàn)靈敏度越好。因變系數(shù)CI=(E2-E1)／(lgD2-lgD1)。

2．篩選

篩選是在預(yù)試驗(yàn)或既往經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用少量動(dòng)物對(duì)多種藥物或造模手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般以P<0.1作為篩選合格的標(biāo)準(zhǔn)，以免漏篩有價(jià)值的藥物。常見(jiàn)篩選實(shí)驗(yàn)有以下幾種。

(1)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)(以急性毒性實(shí)驗(yàn)為例)：篩選解毒藥時(shí)，常將各解毒藥與毒劑的半數(shù)致死量(LD₅₀)合用，連用4只非純品系動(dòng)物，如無(wú)死亡，表明該藥篩選合格(P<0.1)；如有一只動(dòng)物死亡時(shí)，可增加3只動(dòng)物再試，如3只不死，也為篩選合格?？傊?dāng)死亡率為0／4、1／7、2／9、3／12、4／14時(shí)均可認(rèn)為篩選合格。當(dāng)然，篩選合格表示值得進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，不一定正式實(shí)驗(yàn)必定有良好結(jié)果。

(2)概率判別實(shí)驗(yàn)：本法應(yīng)用范圍更廣，對(duì)幾只動(dòng)物用藥檢測(cè)其陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)，就可根據(jù)概率論推算出該藥陽(yáng)性率的大致情況，參見(jiàn)表4-8。

表4-8  概率判別實(shí)驗(yàn)（P<0.1）

一、LD₅₀值測(cè)定

1．要求和注意事項(xiàng)

(1)動(dòng)物：多用非純品系動(dòng)物(能反應(yīng)個(gè)體差異)，如小鼠，健康雌雄各半，20±2g為宜，日齡達(dá)到性成熟。

(2)實(shí)驗(yàn)條件：在有控制的室溫、光照、飼養(yǎng)和衛(wèi)生條件下進(jìn)行。

(3)藥物及給藥途徑：以靜脈注射、腹腔注射和灌胃為主，最好和臨床上給藥途徑相同。小鼠的用藥量標(biāo)準(zhǔn)為：灌胃給藥應(yīng)小于1ml；靜脈注射應(yīng)小于0.2ml；腹腔注射應(yīng)小于1ml。另外，藥液pH值及滲透壓應(yīng)在生理范圍內(nèi)。

(4)觀察項(xiàng)目和時(shí)間：記錄毒性反應(yīng)的癥狀、原因以及致死時(shí)間、致死藥量、致死動(dòng)物數(shù)量等，當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織病變時(shí)，應(yīng)取材做病理切片，必要時(shí)做組織學(xué)檢查，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察7d。

(5)實(shí)驗(yàn)報(bào)告：必須說(shuō)明實(shí)驗(yàn)條件，制定LD₅₀值為全面表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)求出

95％可信區(qū)間和LD₁₀來(lái)表示誤差限度和量效關(guān)系，通過(guò)LD₅₀和LD₁₀算出LD₅、LD₉₅以

及回歸系數(shù)。

(6)LD₅₀測(cè)定法：方法很多，有加權(quán)機(jī)率單位法(Bliss法)、目測(cè)機(jī)率單位法、目測(cè)圖解法、寇氏法(Korlbor)等，對(duì)短期內(nèi)致死藥物還可采用序貫法。

(7)對(duì)于中毒表現(xiàn)和致死原因的分析應(yīng)給予充分重視。

2．LD₅₀值測(cè)定步驟

(1)預(yù)試驗(yàn)：根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或文獻(xiàn)找出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物0和100％死亡的劑量，即上下限劑量(Dn、Dm)。對(duì)于無(wú)毒性參考資料的藥物，一般先配制最大濃度藥劑，然后倍比稀釋成多個(gè)劑量，方法是每組取4只小鼠，按估計(jì)劑量梯度依次給藥。如某組死亡數(shù)為4／4，其前一組為2／4或3／4則以該組劑量定為Dm，如前一組是0／4或1／4，則以該組劑量的1.5倍定為Dm，同法找出Dn，這樣找出的Dm，Dn比較可靠，為正式實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

(2)分組：以4～9組為宜，各組給藥劑量按等比關(guān)系排列。

(3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算LD50：

LD₅₀的95％平均可信限LD₅₀±1.4×(LD₈₄一LD₁₆)／

其中N' 為5％～95％致死率間動(dòng)物數(shù)。

二、慢性毒性實(shí)驗(yàn)

1．動(dòng)物選擇

至少采用兩種不同種屬的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，即嚙齒類動(dòng)物(大鼠、小鼠等)和哺乳類動(dòng)物(犬、猴等)。一般常采用大鼠和犬兩種，雌雄各半，且動(dòng)物數(shù)量不宜太少，要滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的要求。動(dòng)物的進(jìn)化程度越高，對(duì)藥物的敏感性越強(qiáng)，慢性毒性實(shí)驗(yàn)的周期較長(zhǎng)，所以要盡量選用年齡較小的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且選用未成年的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在迅速生長(zhǎng)時(shí)期，可以發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)生長(zhǎng)及各組織器官成熟的影響。

慢性毒性實(shí)驗(yàn)開(kāi)始選擇的小鼠年齡最好是2～3周，體重8～10g，而大鼠不超過(guò)3周，體重50～60g。但是避孕藥物的毒性實(shí)驗(yàn)則要求必須使用性成熟動(dòng)物，如小鼠應(yīng)60日齡以上，大鼠應(yīng)在120日齡以上。

2．劑量選擇

    常用三個(gè)劑量組，大動(dòng)物可用兩個(gè)劑量組，并嚴(yán)格按要求設(shè)動(dòng)物對(duì)照組。高劑量組(LD₅₀的1／10～1／4劑量)應(yīng)有輕微可見(jiàn)的毒性反應(yīng)(或者某些化驗(yàn)指標(biāo)有明確而輕微的變化)。中劑量組按LD₅₀的1／30～1／10定量，最低劑量組應(yīng)是閾劑量組或是無(wú)作用劑量組，具體劑量依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?/p>

3．給藥途徑

最好選擇臨床試用的給藥途徑。

4．給藥期限

最好是臨床試用的用藥時(shí)間(連續(xù)給藥)的3～4倍，臨床用藥30d以上者，動(dòng)物給藥至少半年。

5．觀察指標(biāo)

包括體征、常規(guī)血、尿檢查、臟器解剖及肉眼觀察、生化指標(biāo)檢查等(如新藥則按其國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)核查應(yīng)有項(xiàng)目)。做病理切片進(jìn)行組織學(xué)檢查(二十幾個(gè)臟器)，必要時(shí)行骨髓檢查、酸堿平衡、水和電解質(zhì)代謝等。

由于在慢性毒性實(shí)驗(yàn)中，受試藥物的給藥劑量較低，往往一些觀察指標(biāo)變化程度較小，因此需注意：在給藥前要觀察并記錄預(yù)計(jì)的觀察指標(biāo)，以利于給藥后的比較；在給藥期間進(jìn)行定期指標(biāo)觀察時(shí)，對(duì)照組需同步觀察；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，主張將最高劑量組與對(duì)照組各留部分動(dòng)物繼續(xù)飼養(yǎng)1～2個(gè)月，以便對(duì)已出現(xiàn)變化的指標(biāo)進(jìn)行追蹤觀察，有助于探討受試藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有無(wú)后續(xù)作用，以及損傷可否恢復(fù)。

6．結(jié)果定論

按觀察記錄的結(jié)果定論，但不應(yīng)忽視綜合因素及其他因素對(duì)結(jié)果的影響。

三、致癌實(shí)驗(yàn)

1．動(dòng)物選擇

其選擇動(dòng)物最重要的依據(jù)是對(duì)誘發(fā)腫瘤的易感性，所以應(yīng)考慮物種、品系、年齡和性別。物種的選擇對(duì)受試物有特定的靶器官時(shí)尤為重要。同時(shí)還應(yīng)考慮選擇腫瘤自發(fā)率低、抗病力強(qiáng)且易管理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一般多選用大、小鼠，雌雄各半，100只以上做一組，動(dòng)物多為近交系的第一代雜交動(dòng)物。

2．劑量選擇

此點(diǎn)較難，但非常重要，一般使用三個(gè)劑量，其中最高劑量應(yīng)為最大耐受量，理想的最大耐受量不應(yīng)致死，也不引起可能縮短壽命的毒性表現(xiàn)和病理改變，并且與對(duì)照組相比的體重下降不大于10％，中劑量為高劑量的1／4～1／3，低劑量最好相當(dāng)于或低于人類實(shí)際可能接觸的劑量，同時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)好陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組。

3．觀察指標(biāo)

體征，一般癥狀，定期稱體重，最主要是密切觀察有無(wú)腫瘤發(fā)生，如生長(zhǎng)有腫瘤，則需要做病理組織切片或電鏡觀察其病理學(xué)變化。

4．結(jié)果定論

一般以組織學(xué)結(jié)果判定。

四、其他簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)

1．局部刺激性實(shí)驗(yàn)

(1)動(dòng)物選擇：最好選用與人類皮膚、黏膜反應(yīng)比較相近的動(dòng)物，如家兔、豚鼠和小型豬等。動(dòng)物種屬依據(jù)要觀察的指標(biāo)和模型的合理性進(jìn)行選擇，通常一個(gè)實(shí)驗(yàn)類型選擇一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)價(jià)。刺激性實(shí)驗(yàn)結(jié)果從動(dòng)物外推到人的可靠性有限，如果用兩種動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)得到類似的結(jié)果，則會(huì)增加從動(dòng)物外推到人的可靠性。

(2)劑量選擇：可選擇幾種不同濃度的制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中包括擬用于臨床研究的濃度，為臨床研究的安全性提供選擇依據(jù)。可以通過(guò)改變給藥頻次進(jìn)行劑量的調(diào)整。對(duì)于局部用膏狀制劑，在給藥面積不變的情況下，不應(yīng)通過(guò)增加厚度來(lái)滿足增加給藥劑量的目的。

(3)給藥途徑：一般應(yīng)與臨床給藥途徑一致，否則應(yīng)加以說(shuō)明。

(4)給藥部位：一般應(yīng)選擇與臨床應(yīng)用相似的部位。并注意對(duì)可能接觸到受試物的周?chē)M織的影響。設(shè)計(jì)劑量和給藥頻次時(shí)，應(yīng)考慮受試動(dòng)物給藥部位的解剖和生理特點(diǎn)，保證受試物在給藥部位的有效暴露時(shí)間。

(5)觀察指標(biāo)：首先要進(jìn)行肉眼觀察，詳細(xì)描述動(dòng)物局部反應(yīng)，包括紅斑、水腫、充血程度及范圍，并以計(jì)分的方式表示，同時(shí)觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、行為、體征等；其次進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，應(yīng)詳細(xì)描述給藥部位的病理變化，并進(jìn)行半定量分析、判斷，提供相應(yīng)的組織病理學(xué)照片；最后進(jìn)行可逆性觀察，若出現(xiàn)刺激性反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)行停藥后的恢復(fù)期觀察，以明確毒性反應(yīng)的恢復(fù)情況。

2．過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)

通常選用體重300～400g的豚鼠，并需要仔細(xì)觀察過(guò)敏反應(yīng)的一系列指標(biāo)。

3．異常毒性實(shí)驗(yàn)

最好選用同一品種小鼠(純品系)，體重17～20g，雌性無(wú)孕，健康無(wú)傷。

4．熱原檢查

目前常選用家兔為本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在熱原實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前進(jìn)行家兔的體溫監(jiān)測(cè)，只有在監(jiān)測(cè)的4h內(nèi)，家兔的體溫差異不超過(guò)0.4℃的即可被用來(lái)進(jìn)行熱原實(shí)驗(yàn)，而且在給約之前的30min內(nèi)體溫差不超過(guò)0.2℃的家兔方可給藥。其給藥途徑為耳緣靜脈注射。在給藥后4h內(nèi)需要密切監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)用家兔的體溫變化。