原核注射和ES細胞的基因打靶在小鼠上取得了巨大的成功，但是這些方法在其他物種上尚未獲得明顯成功，促使科學(xué)家尋找其他的替代方法。如，研究表明用反轉(zhuǎn)錄病毒特別是慢病毒載體可有效地將外源DNA導(dǎo)入卵母細胞。反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的雄性生殖系干細胞已成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本結(jié)構(gòu)：反轉(zhuǎn)錄病毒載體的兩端有長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。LTR含有啟動子和增強子序列，可以轉(zhuǎn)錄表達外源基因。在反轉(zhuǎn)錄病毒載體的5' LTR序列后，有病毒包裝信號，去掉包裝蛋白基因，留下的空間可用于克隆外源基因。反轉(zhuǎn)錄病毒載體克隆容量有限，插入的DNA片段需小于10kb。包裝蛋白基因克隆入表達載體，制備包裝細胞系。用反轉(zhuǎn)錄病毒表達載體轉(zhuǎn)染包裝細胞系或者與病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染293T細胞制備病毒顆粒；然后用病毒上清感染胚胎細胞或ES細胞。由于透明帶構(gòu)成一個物理屏障，不能直接感染受精卵，可以將重組病毒上清注射到卵透明帶與卵質(zhì)膜間隙；或者先去掉透明帶，然后感染無透明帶的受精卵細胞；也可用顯微注射操作系統(tǒng)，將病毒上清注入囊胚腔內(nèi)，感染早期胚胎。將胚胎移入受體動物的輸卵管，發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。病毒感染后，反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組釋放入宿豐細胞，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，在病毒整合酶和其末端特異核酸序列作用下，隨機整合到宿主細胞基因組中。

早期使用小鼠白血病反轉(zhuǎn)錄病毒(moloney murine leukemia virus，MMLV)感染制備轉(zhuǎn)基因動物，后來發(fā)現(xiàn)MMLV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因，進入動物基因組后會發(fā)生基因表達沉默現(xiàn)象。最近發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因在動物體內(nèi)更穩(wěn)定。反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法轉(zhuǎn)基因法操作簡單，宿主范圍廣，不受胚胎發(fā)育階段的影響，無導(dǎo)入基因的連環(huán)化現(xiàn)象，且單一位點單拷貝整合、整合效率高。該方法的不足之處是需要生產(chǎn)帶有外源基因的反轉(zhuǎn)錄病毒；插入外源基因的長度有一定限制。反轉(zhuǎn)錄病毒整合只能發(fā)生在分裂期的細胞，而重組慢病毒可以用來感染未分裂的細胞。通過慢病毒載體感染的小鼠受精卵已制成許多轉(zhuǎn)基因動物模型，如阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因大鼠模型。