前面我們談到了來(lái)自基因組暗物質(zhì)神秘的非編碼長(zhǎng)鏈RNA（lncRNA）、非編碼環(huán)形RNA（ciRNA）、微小的RNA（miRNA），現(xiàn)在我們?cè)賮?lái)談?wù)勁c微小的RNA（miRNA）有密切關(guān)系的小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA）。介紹他們之前我們需要先了解下RNA干擾（RNAi）技術(shù)。

RNA干涉(RNAinterference，RNAi)是有效沉默或抑制目標(biāo)基因表達(dá)的過(guò)程，指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，從而導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失的現(xiàn)象。RNA干擾由轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈RNA激活。沉默機(jī)制可導(dǎo)致由小干擾RNA（siRNA）或短發(fā)夾RNA（shRNA）誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)靶mRNA的降解，或者通過(guò)小RNA（miRNA）誘導(dǎo)特定mRNA翻譯的抑制。通過(guò)短反義核酸（siRNA和shRNA序列）鎖定細(xì)胞mRNA，從而實(shí)現(xiàn)其隨后的降解。這反過(guò)來(lái)阻斷了該蛋白的進(jìn)一步表達(dá)/聚集，導(dǎo)致其水平的下降，最終實(shí)現(xiàn)抑制作用。

RNA干擾最初是怎樣發(fā)現(xiàn)的呢？我們也簡(jiǎn)單回顧下：

早在1984年人們就發(fā)現(xiàn)反義RNA能夠抑制基因的表達(dá)，但后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA在抑制基因表達(dá)方面實(shí)際上比單鏈RNA更有效。RNA干擾現(xiàn)象是1990年由約根森（Jorgensen）研究小組在研究查爾酮合成酶對(duì)花青素合成速度的影響時(shí)所發(fā)現(xiàn)的，為得到顏色更深的矮牽?；ǘ^(guò)量表達(dá)查爾酮合成酶，結(jié)果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽?；?，并且過(guò)量表達(dá)查爾酮合成酶的矮牽?；ㄖ胁闋柾铣擅傅臐舛缺日０珷颗；ㄖ械臐舛鹊?0倍。約根森推測(cè)外源轉(zhuǎn)入的編碼查爾酮合成酶的基因同時(shí)抑制了花中內(nèi)源查爾酮合成酶基因的表達(dá)。1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粗糙鏈孢霉中發(fā)現(xiàn)了外源導(dǎo)入基因可以抑制具有同源序列的內(nèi)源基因的表達(dá)。1995年，Guo和Kemphues在線(xiàn)蟲(chóng)中也發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。1998年，安德魯·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（C.elegans）中進(jìn)行反義RNA抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，作為對(duì)照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA顯示出了更強(qiáng)的抑制效果。從與靶mRNA的分子量比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強(qiáng)于理論上1:1配對(duì)時(shí)的抑制效果，因此推測(cè)在雙鏈RNA引導(dǎo)的抑制過(guò)程中存在某種擴(kuò)增效應(yīng)并且有某種酶活性參與其中。并且將這種現(xiàn)象命名為RNA干擾。

RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，利用具有同源性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用，是對(duì)特定信使RNA（mRNA）進(jìn)行降解的指導(dǎo)要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。

siRNA和shRNA的作用機(jī)制

兩個(gè)在RNAi途徑的基因沉默中具有實(shí)質(zhì)利害關(guān)系的是雙鏈小干擾RNA（siRNA）和基于載體的短發(fā)夾RNA（shRNA）。雖然siRNA和shRNA（圖1）都可用于蛋白沉默，但它們的作用機(jī)制有所不同（圖2）。不管是長(zhǎng)的雙鏈RNA還是短的約21bp堿基對(duì)的雙鏈都能夠直接被轉(zhuǎn)運(yùn)到組織培養(yǎng)的細(xì)胞中。雖然有一些報(bào)道提到siRNA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)是被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中的，但更普遍的看法是它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中聚集。長(zhǎng)的雙鏈RNA與Dicer一起形成復(fù)合物，雙鏈特異性的核糖核酸酶III能夠?qū)⑺鼈兲幚沓蓭в袃蓚€(gè)游離堿基的長(zhǎng)度為21-23nt的siRNA。隨后這些siRNA片段與RISC結(jié)合，RISC由Argonaute-2（Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結(jié)合蛋白（TRBP）組成。然后RNA的兩條鏈分開(kāi)，其中一條鏈從復(fù)合物上分離。5'端雙鏈穩(wěn)定性最低的那條鏈被選擇出來(lái)，穩(wěn)定的并入沉默復(fù)合物中。shRNA在轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞核中的合成，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖區(qū)成對(duì)的反義和正義鏈與未配對(duì)的成環(huán)核苷酸連接在一起（圖1b和1c）。通過(guò)與miRNA的加工相同的RNAi機(jī)制，shRNA被加工成siRNA。使用細(xì)菌或病毒載體，shRNA被導(dǎo)入靶細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，在某些情況下，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中。根據(jù)驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化轉(zhuǎn)錄。在被Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)之前，這些初始的前體結(jié)構(gòu)需要首先用Drosha及其雙鏈RNA結(jié)合伴侶DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA隨后被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除發(fā)卡結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生在兩個(gè)3‘末端帶有兩個(gè)游離堿基的20-25nt的雙鏈siRNA。這一有活性的siRNA隨后被整合到沉默復(fù)合物上去。

圖1.siRNA和shRNA結(jié)構(gòu)。

（A）siRNAs是短的RNA雙鏈，在3‘端有兩個(gè)堿基的游離。

（B）shRNA由正義鏈和反義鏈通過(guò)環(huán)狀序列隔開(kāi)共同組成。

（C）shRNA 構(gòu)建用于插入表達(dá)載體。

圖2.RNAi介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制。在細(xì)胞核表達(dá)后，shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們與Dicer結(jié)合去除環(huán)狀序列。在這一點(diǎn)上，它們與siRNA的加工方式（以短的雙鏈形態(tài)導(dǎo)入細(xì)胞，然后被Dicer識(shí)別）相同。在與RISC結(jié)合并去掉其中一條RNA鏈后，它們識(shí)別mRNA占有互補(bǔ)序列，導(dǎo)致其降解。

一旦被整合到RISC后，shRNA和siRNA識(shí)別靶mRNA和降解的過(guò)程基本上是相同的。作為RISC的一部分，siRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)以序列特異性的方式結(jié)合到靶mRNA，從而利用Ago-2的核酸酶H樣活性裂解靶RNA的雙鏈中心附近的磷酸骨架。某些生物的這個(gè)系統(tǒng)有一個(gè)有趣的特點(diǎn)，siRNA與靶mRNA的退火使siRNA作為引物，而靶mRNA作為依賴(lài)于RNA的RNA聚合酶的模板。這就合成出一個(gè)新的雙鏈RNA，然后由Dicer酶加工，形成正反饋循環(huán)，增加了siRNA的量。應(yīng)當(dāng)指出的siRNA通常需要完全同源才能誘導(dǎo)降解。

miRNA與siRNA的相同點(diǎn)和區(qū)別

miRNA與siRNA之間有許多相同之處：

1.二者的長(zhǎng)度都約在22nt左右。

2.二者都依賴(lài)Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。

3.二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在。

4.二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰，如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊。

5.miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。

miRNA與siRNA的不同點(diǎn)：

1.根本區(qū)別是miRNA是內(nèi)源的，是生物體的固有因素；而siRNA是人工體外合成的，通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物。

2.結(jié)構(gòu)上，miRNA是單鏈RNA，而siRNA是雙鏈RNA。

3.Dicer酶對(duì)二者的加工過(guò)程不同，miRNA是不對(duì)稱(chēng)加工，miRNA僅是剪切pre-miRNA的一個(gè)側(cè)臂，其他部分降解；而siRNA對(duì)稱(chēng)地來(lái)源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。

4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3′-UTR區(qū)，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。

5.在作用方式上，miRNA可抑制靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致靶標(biāo)基因降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用，而siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

6.miRNA主要在發(fā)育過(guò)程中起作用，調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)，而siRNA不參與生物生長(zhǎng)，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。

RNAi 技術(shù)要點(diǎn)

1.siRNA 的設(shè)計(jì)

RNAi 技術(shù)要求siRNA 反義鏈與靶基因序列之間嚴(yán)格的堿基配對(duì), 單個(gè)堿基錯(cuò)配就會(huì)大大降低沉默效應(yīng), 而且siRNA 還可以造成與其具同源性的其它基因沉默(也叫交叉沉默) , 所以在siRNA 的設(shè)計(jì)中序列問(wèn)題是至關(guān)重要的。要求所設(shè)計(jì)的siRNA 只能與靶基因具高度同源性而盡可能少的與其他基因同源。設(shè)計(jì)siRNA 序列應(yīng)注意以下幾點(diǎn): ①?gòu)陌谢蜣D(zhuǎn)錄本起始密碼子AUG 開(kāi)始, 向下游尋找AA 雙核苷酸序列, 將此雙核苷酸序列和其下游相鄰19 個(gè)核苷酸作為siRNA 序列設(shè)計(jì)模板; ②每個(gè)基因選擇4～5 個(gè)siRNA 序列, 然后運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行同源性比較, 剔除與其他基因有同源性的序列, 選出一個(gè)特異性最強(qiáng)的siRNA; ③盡量不要以mRNA 的5'端和3'端非翻譯區(qū)及起始密碼子附近序列作為設(shè)計(jì)siRNA的模板, 因?yàn)檫@些區(qū)域有許多調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點(diǎn)(如翻譯起始復(fù)合物) , 調(diào)節(jié)蛋白會(huì)與RISC 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶序列, 降低siRNA 的基因沉默效應(yīng)。

2.siRNA 的合成

目前獲得siRNA 主要有體外制備和體內(nèi)表達(dá)兩種方式。

2.1.體外制備

2.1.1.化學(xué)合成

許多公司都可以根據(jù)用戶(hù)要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3—4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。

最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究

不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素

2.1.2.體外轉(zhuǎn)錄

以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。

最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。

不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。

2.1.3.用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢(qián)（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因?，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。

最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型

不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療

在體外(in vit ro) 可用不同的方法將siRNA導(dǎo)入靶細(xì)胞, 一般來(lái)講化學(xué)合成和體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA 可用電轉(zhuǎn)移(elect roporation) 、微注射和轉(zhuǎn)染的方法引入細(xì)胞。而表達(dá)質(zhì)粒則常通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入靶細(xì)胞然后再表達(dá)siRNA。向體內(nèi)(in vivo) 導(dǎo)入siRNA 的研究工作也已有報(bào)道, 如有研究者用靜脈注射的方法將合成的siRNA 引入動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因功能的研究。

2.2體內(nèi)表達(dá)

前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專(zhuān)門(mén)的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。

2.2.1.siRNA表達(dá)載體

多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴(lài)三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。這三類(lèi)啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類(lèi)載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。

最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。

不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。

2.2.2. siRNA表達(dá)框架

siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECS)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNA pol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。

這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中②不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子

不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

RNA干擾（RNAi）技術(shù)的應(yīng)用

RNAi在基因沉默(silent gene)方面具有高效性和簡(jiǎn)單性，所以是基因功能研究的重要工具。大多數(shù)藥物屬于標(biāo)靶基因（或疾病基因）的抑制劑，因此RNAi 模擬了藥物的作用，這種功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢(shì)。因此, RNAi 在今天的制藥產(chǎn)業(yè)中是藥物靶標(biāo)確認(rèn)的一個(gè)重要工具。同時(shí)，那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為RNAi藥物。

在藥物標(biāo)靶發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)方面，RNAi技術(shù)已獲得了廣泛的應(yīng)用。生物技術(shù)公司或制藥公司通常利用建立好的RNAi文庫(kù)來(lái)引入細(xì)胞，然后通過(guò)觀察細(xì)胞的表型變化來(lái)發(fā)現(xiàn)具有功能的基因。如可通過(guò)RNAi文庫(kù)介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)發(fā)現(xiàn)能抑制腫瘤的基因。一旦所發(fā)現(xiàn)的基因?qū)儆诳捎盟幍陌袠?biāo)（如表達(dá)的蛋白在細(xì)胞膜上或被分泌出細(xì)胞外），就可以針對(duì)此靶標(biāo)進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選。此外，被發(fā)現(xiàn)的靶標(biāo)還可用RNAi技術(shù)在細(xì)胞水平或動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步確認(rèn)。

在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用于臨床測(cè)試用于幾種疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肥胖癥等。在抗病毒治療方面，帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病已經(jīng)開(kāi)始初步采用RNA干擾療法。腫瘤治療方面也已經(jīng)取得了一些成果。