摘要：目的 探討血清淀粉樣蛋白 A（SAA）在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá)及其意義。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real－time PCR）、免疫組化技術(shù)檢測 11 例尋常型銀屑病患者皮損組織及皮損周圍組織、8 例非銀屑病患者的正常皮膚組織中 SAA 在 mRNA 和蛋白不同水平的表達(dá)情況。 結(jié)果 Real－time PCR 檢測結(jié)果顯示，銀屑病皮損區(qū) SAA mRNA 水平明顯高于皮損周圍組、正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。免疫組化顯示 3 組皮損組織均有 SAA 蛋白表達(dá)，且尋常型銀屑病組表達(dá)明顯高于皮損周圍組、正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0．05）。
結(jié)論 尋常型銀屑病皮損組織中 SAA 在基因及蛋白水平表達(dá)均升高，提示 SAA 可能與尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。血清淀粉樣蛋白 A （Serum amyloid A, SAA）是一種組織淀粉樣蛋白 A 的前體物質(zhì)，屬于急性期反應(yīng)蛋白[1]。目前，在細(xì)菌、病毒感染、動脈粥樣硬化、冠心病、急性移植排斥反應(yīng)、腫瘤等疾病中均檢測到血清 SAA 升高[2]。IL-23/Th17 通路是銀屑病發(fā)病的核心機(jī)制，近期研究發(fā)現(xiàn)，SAA 在 IL-23/Th17 通路的活化過程中發(fā)揮一定作用[3-4]。本研究采用實時熒光定量 PCR（Real-time PCR）和免疫組化法檢測SAA 在尋常型銀屑病皮損表達(dá)分布差異的變化。
1 對象與方法
1.1 研究對象 2013 年 10 月—2014 年 8 月，在上海市皮膚病醫(yī)院經(jīng)臨床及病理證實的尋常型銀屑病患者 11 例，其中男 6 例，女 5 例。采用銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分，總評分 PASI≥ 10 及皮損面積 >10％的中、重度尋常型銀屑病患者。對照組織標(biāo)本來自外科手術(shù)軀干或四肢部位的正常組織（8 例）。將標(biāo)本分 2 部分，各約 50 mg 組織，分別放入標(biāo)記好的凍存管立即液氮速凍，-80 冰箱保存，用于 Real-time PCR 檢測；另一部分用 4％甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于免疫組化。
1.2 主要試劑 SAA 兔抗人多克隆抗體為英國Abcam 公司產(chǎn)品；過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）酶底物顯色試劑盒為武漢博士德生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Real-time PCR 試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。
1.3 方法
1.3.1 Real-time PCR 法檢測 SAA 的表達(dá) 凍存組織研磨后用應(yīng)用相關(guān)試劑提取總 RNA；紫外分光光度計測定 RNA 濃度和純度。RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后，進(jìn)行實時熒光定量 PCR 檢測。引物設(shè)計合成 SAA 表達(dá)所需的引物序列上游為：5’-CGAAGC TTC TTT TCG TTC CTT-3’，下游為 5’-CACCAT GGC CAA AGA ATC TC-3’；內(nèi)參 GAPDH 上游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’; 下游 5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’。選用兩管反應(yīng)體系對目的基因和內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，建立總體積為 20 μL 的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。取 2 μL cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94預(yù)變性 30 s，95 變性5 s，58 退火 34 s，60 延伸 1 min，共進(jìn)行 40 個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后 60 延伸 10 min，4 保存。
1.3.2 免疫組化 石蠟標(biāo)本切片脫蠟水化；0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓修復(fù) 2 min，室溫自然冷卻；3％H2O2 室溫避光孵育 10 min；滴加 SAA 一抗，4 濕盒孵育過夜；次日，再滴加二抗，室溫孵育30 min 后 DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。上述各步驟之間均以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗 3 次。每次實驗均設(shè)立一個陰性對照，即 PBS 代替一抗，其余步驟相同，陰性對照DAB 不能使其顯色。所有組織染色條件相同。
1.3.3 免疫組化染色結(jié)果判定 光鏡下觀察，表現(xiàn)為棕黃色顆粒即 SAA 表達(dá)陽性，著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色。由 2 位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生采用雙盲法觀察每張切片，隨機(jī)選取 5 個不重疊的高倍鏡視野（×400），按染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。按染色強(qiáng)度評分：無著色計 0 分，淡黃色（弱）計 1 分，淺棕色（中）計 2 分，深棕色（強(qiáng)）計 3分；按陽性細(xì)胞所占比例評分：< 5％計 0 分，5％～25％計 1 分，26％～50％計 2 分，51％～75％計 3 分，>75％計 4 分，2 種評分相加，≤3 分判為陰性（-），> 3分為陽性（+）。
1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。對尋常型銀屑病皮損、非皮損以及正常皮膚組織 SAA 與 GAPDH 比值進(jìn)行單因素方差分析，實驗結(jié)果以 x±s 表示；采用卡方檢驗比較 SAA 蛋白表達(dá)陽性率。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 SAA mRNA 表達(dá)水平 Real-time PCR 實驗結(jié)果顯示尋常型銀屑病皮損組織 mRNA 表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常組織（7.15±2.93 vs. 2.36±1.49，P< 0.05）；尋常型銀屑病皮損組織表達(dá)高于皮損周圍組織（7.15±2.93 vs. 3.23±2.00，P<0.05）；而皮損周圍組與 正常對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （3.23±2.00 vs. 2.36±1.49，P>0.05），見圖 1。

2.2 免疫組化染色觀察 正常皮膚中 SAA 染色主要位于表皮層的基底細(xì)胞層。在尋常型銀屑病皮損中 SAA 染色陽性細(xì)胞彌漫分布于表皮層的棘細(xì)胞層，真皮乳頭處單個核細(xì)胞也有表達(dá)。而 SAA 在病變周圍組織亦表達(dá)于表皮層的基底細(xì)胞層，與正常對照組表達(dá)相近，見圖 2。

2.3 SAA 蛋白表達(dá)情況 SAA 在尋常型銀屑病皮損組織中表達(dá)的陽性率為 90.9％（10/11），高于皮損周圍組（18.2％，2/11，χ2 =11.73，P<0.01）和正常對照組（12.5％，1/8，χ2=11.68，P<0.01），而正常對照組與皮損周圍組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2 =0.11，P=0.73）。

3 討論
急性期反應(yīng)的重要特征是急性期蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)且表達(dá)水平快速升高。常見的急性期蛋白包括SAA 和 C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein, CRP）[1]。在血管粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥性腸病等許多炎癥性疾病中，急性期蛋白已經(jīng)成為一個重要的臨床標(biāo)記物。同時，急性期蛋白還參與調(diào)節(jié)天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在小鼠哮喘模型中，SAA 能夠促進(jìn) Th17 細(xì)胞的分化維持[5] 。在外周血單核細(xì)胞中，SAA 還可誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞分泌 IL-23[6]，而IL-23 恰恰是 Th17 細(xì)胞分化和表型維持的關(guān)鍵細(xì)胞因子。此外，一項近期的研究顯示：SAA 可以通過Notch1 信號通路，促進(jìn)銀屑病皮損部位真皮血管新生[7]。以上研究均提示，SAA 可能在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用。
IL-23/Th17 軸失衡是銀屑病發(fā)病機(jī)制中公認(rèn)的經(jīng)典理論。銀屑病的 IL-23/Th17 軸從概念上可分為 3 個階段：第一階段真皮樹突狀細(xì)胞持續(xù)表達(dá)IL-23，維持 Th17 細(xì)胞持續(xù)活化并釋放其特征性細(xì)胞因子 IL-17 和 IL-22；第二階段 IL-17 和 IL-22作用于表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、活化；第三階段活化的角質(zhì)形成細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子、趨化因子及抗菌肽，吸引并作用于真皮 T 淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，正反饋放大炎癥反應(yīng)，觸發(fā)并維持銀屑病進(jìn)程。
本研究通過 Real-time PCR 和免疫組化等方法表明，SAA 在尋常型銀屑病皮損中，尤其是表皮角質(zhì)形成的細(xì)胞中過度表達(dá)，與正常對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示 SAA 可能不僅是一種存在于循環(huán)中的急性期蛋白，而且是一種重要的局部炎癥介質(zhì)。盡管以往的研究報道循環(huán)中的 SAA 主要來源于肝細(xì)胞，在多種組織器官中都可以檢測出 SAA 的表達(dá)，包括動脈粥樣硬化的斑塊區(qū)、阿爾茲海默癥患者腦組織以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織。筆者的觀察擴(kuò)展了以往的研究，證實銀屑病患者皮損可能是另一種重要的 SAA 來源。銀屑病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的 SAA 可能通過旁分泌的形式作用于真皮內(nèi)的免疫活性細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致銀屑病正反饋加重。
綜上所述，SAA 在尋常型銀屑病皮損組織中表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示 SAA 在尋常型銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。但 SAA 對表皮角質(zhì)形成細(xì)胞以及真皮免疫活性細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，仍需深入研究。