近年來腫瘤代謝相關(guān)研究越發(fā)火熱，高分文章不斷涌現(xiàn)，國自然中標(biāo)基金數(shù)目也逐年增加。而且其他腫瘤學(xué)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域中也發(fā)現(xiàn)腫瘤代謝關(guān)鍵酶的異常表達(dá)以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的異常積累與腫瘤免疫，腫瘤干細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳修飾密切相關(guān)。

pubmed中的“Tumor energy metabolism ”的文章發(fā)表量

2018國自然基金中細(xì)胞能量代謝的基金數(shù)在50個(gè)左右

本系列將以幾個(gè)篇幅詳細(xì)介紹一下腫瘤代謝的基本概念、研究思路、實(shí)驗(yàn)方法和論文套路。

腫瘤糖代謝

早在1924年Warburg發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞有著不一樣的糖代謝模式。除了有氧狀態(tài)下葡萄糖的攝取速率更高之外，即使在氧濃度正常的條件下，腫瘤細(xì)胞仍然傾向于無氧酵解，并能將代謝的乳酸分泌出細(xì)胞外，防止底物堆積。顯然，這種有氧糖酵解（aerobic glycolysis）的用氧模式，能讓腫瘤細(xì)胞在大量分裂增殖時(shí)候游刃有余，毫無壓力。Warburg因此獲得1931年的諾獎(jiǎng)。

目前，“Warburg效應(yīng)”作為腫瘤的一個(gè)典型標(biāo)志已被廣泛認(rèn)可。2011年，Robert A.Weinberg教授在Cell雜志發(fā)表綜述，將腫瘤異常的代謝表型列入腫瘤十大特征之一。人們幾乎在所有腫瘤中都證實(shí)了Warburg效應(yīng)的存在。同時(shí)近年來的研究中也發(fā)現(xiàn)其他諸多代謝通路包括脂肪酸代謝、膽固醇代謝、谷氨酰胺代謝、絲氨酸代謝、一碳單位代謝、膽堿代謝等，在腫瘤細(xì)胞中均發(fā)生了重編程變化。但是糖代謝的異常是腫瘤代謝中最為常見和基礎(chǔ)的研究類型。

研究思路

腫瘤代謝研究中的靶點(diǎn)主要著眼于以下兩方面

第一是代謝過程中關(guān)鍵酶，研究其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄后修飾，最終導(dǎo)致酶表達(dá)量的變化以及活性的變化。例如：HIF-1α是Warburg效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，通過與糖酵解基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive elements, HRE）結(jié)合來促進(jìn)糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)。c-Myc能夠直接轉(zhuǎn)錄激活編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1 (GLUT1)和乳酸脫氫酶 (LDHA) 的糖酵解基因，并促進(jìn)異常糖酵解。p53腫瘤抑制因子通過直接抑制GLUT1和GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制葡萄搪攝取和乳酸產(chǎn)量。在這些經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子外尋找其他的諸如諸如非編碼RNA，表觀遺傳修飾等調(diào)節(jié)是最近研究的趨勢(shì)和熱點(diǎn)。

第二是代謝異常導(dǎo)致的中間產(chǎn)物的積累，進(jìn)而影響表觀遺傳修飾，藥物抗性等其他腫瘤生理過程。如最近的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中甲硫氨酸需求量增加導(dǎo)致其甲基化修飾上調(diào)進(jìn)而上調(diào)腫瘤干細(xì)胞成瘤性。

這兩種研究套路類型我們將在本系列后續(xù)兩篇文章中分別舉例介紹。

研究方法與實(shí)驗(yàn)技術(shù)

腫瘤代謝研究中也需要用到一些特有的實(shí)驗(yàn)方法。如在腫瘤的氧化糖酵解研究中，氧耗率（OCR），和酸化率（ECAR）常被用于衡量氧化磷酸化和糖酵解的強(qiáng)度。其具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

通過加入藥物寡霉素，FCCP，魚藤酮和抗霉素A處理并測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的OCR值，反映細(xì)胞的氧化磷酸化水平。通過檢測(cè)加入葡萄糖，寡霉素，2-DG后的反應(yīng)，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)酸率，確定細(xì)胞糖酵解速率的變化。

（A）96孔生物能量分析儀細(xì)胞培養(yǎng)微型板中單層細(xì)胞的鋪備：將配制好的細(xì)胞懸液利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞密度;取適量體積細(xì)胞懸液至1.5 mL EP管中，計(jì)算所需細(xì)胞數(shù)總量，補(bǔ)充培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）至800μL;將細(xì)胞重新吹勻打散后種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔80μL，同時(shí)在背景校正孔中加入80μL培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）;將細(xì)胞放入37°C，5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

（B）測(cè)量探針板的孵化：向探針板的每個(gè)孔加入140μLpH7.4的校正液，隨后培養(yǎng)過夜（37度，無CO2）過夜（將探針用保鮮膜包住，以免校正液蒸發(fā)過多）。

（C）在顯微鏡下檢查96孔板中單層細(xì)胞的生長情況，確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好。將96孔板中原有的80μL培養(yǎng)基（DMEM + 10％FBS）吸出，向每孔中加入120μL已溫浴至37°C的培養(yǎng)基，輕輕搖動(dòng)96孔細(xì)胞板，將培養(yǎng)基吸出，再向每孔中加入175μL的分析培養(yǎng)基（上述操作要極為小心謹(jǐn)慎，以免細(xì)胞脫離培養(yǎng)板底部）。隨后將96培養(yǎng)板放入到PS裝置中（37°C，無CO2），約1小時(shí)。

（D）測(cè)量探針板中工作液的加入：將事先配制好的濃度分別為8,9,10,10μmol/ L的寡霉素，F(xiàn)CCP，魚藤酮和抗霉素A工作液，按25μL/孔加入到相對(duì)應(yīng)的A，B，C孔中，使這4種藥物的最終濃度均為1μmol/ L（藥物的最終工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞的不同而進(jìn)行優(yōu)化）。

（E）程序的運(yùn)行：根據(jù)公司提供的說明書設(shè)置程序進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，若無文獻(xiàn)報(bào)道則需進(jìn)行摸索條件的細(xì)胞或藥物可根據(jù)說明書給出的建議進(jìn)行程序的設(shè)置），運(yùn)行實(shí)驗(yàn)。導(dǎo)出數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

對(duì)于不同代謝產(chǎn)物在體內(nèi)積累情況則通常會(huì)借助PET-CT等技術(shù)手段。其機(jī)制是，人體不同組織的代謝狀態(tài)不同，在高代謝的惡性腫瘤組織中葡萄糖代謝旺盛，聚集較多，這些特點(diǎn)能通過圖像反映出來，從而可對(duì)病變進(jìn)行診斷和分析。

而腫瘤代謝研究中的其他功能與機(jī)制實(shí)驗(yàn)套路則與常規(guī)腫瘤研究大同小異，具體的研究實(shí)例會(huì)在接下來幾期文章中為大家介紹。