一、轉(zhuǎn)錄組還是基因組？

map常用的工具有bowtie/bowtie2, BWA,SOAP1/SOAP2等。這個問題又會被分成兩個問題，是基因組測序（DNA-seq）還是轉(zhuǎn)錄組測序(mRNA-seq)。其中的區(qū)別是對于真核生物而言，mRNA序列與DNA序列并不完全相同，在經(jīng)歷了后剪切之后，成熟的mRNA可能是原基因的一部分，甚至順序及個別堿基會產(chǎn)生變化。如果是mRNA測序，那map工作就會在DNA測序map的基礎(chǔ)上再多一步，map到轉(zhuǎn)錄組上去。所以最為流行的做法是，（使用BWA來進行ChIP-seq測序）使用bowtie來map DNA測序，使用tophat來map RNA測序。實際上，tophat是通過調(diào)用bowtie來完成工作的。而tophat1和tophat2的差別最主要的就是調(diào)用了bowtie1還是bowtie2。當然如果你只安裝了bowtie1的話，tophat2也可以調(diào)用它

二、bowtie有1和2的差別：

1，bowtie1出現(xiàn)的早，所以對于測序長度在50bp以下的序列效果不錯，而bowtie2主要針對的是長度在50bp以上的測序的。
2，Bowtie 2支持有空位的比對
3，Bowtie 2支持局部比對，也可以全局比對
4，Bowtie 2對最長序列沒有要求，但是Bowtie 1最長不能超過1000bp。
5. Bowtie 2 allows alignments to [overlap ambiguous characters] (e.g. `N`s) in the reference. Bowtie 1 does not.
6，Bowtie 2不能比對colorspace reads.
…………

三、選不選bowtie：

Bowtie 2 在比對大的基因組的時候，工作效果更好一些，如果你是比對兩個特別大的基因組，可以考慮MUMmer，如果你比對的是兩個特別相近且比較小的基因組，可以用[NUCmer], [BLAT], or [BLAST]. 但是Bowtie 2不能比對colorspace reads.

四、Bowtie的簡介：

Bowtie是一個超級快速的，較為節(jié)省內(nèi)存的短序列拼接至模板基因組的工具。它在拼接35堿基長度的序列時，可以達到每小時2.5億次的拼接速度。
Bowtie并不是一個簡單的拼接工具，它不同于Blast等。它適合的工作是將小序列比對至大基因組上去。它最長能讀取1024個堿基的片段。模板最小尺寸不能小于1024堿基，而短序列最長而不能超過1024堿基。換言之，bowtie非常適合下一代測序技術(shù)。
在 使用bowtie前，需要使用bowtie-build來構(gòu)建比對模板。

Bowtie設計思路是：1）短序列在基因組上至少有一處最適匹配， 2）大部分的短序列的質(zhì)量是比較高，3）短序列在基因組上最適匹配的位置最好只有一處。這些標準基本上和RNA-seq, ChIP-seq以及其它一些正在興起的測序技術(shù)或者再測序技術(shù)的要求一致。

使用tophat的基本步驟是：
理解bowtie
使用tophat來mapping reads。其命令常見的形式為：
/path-to-bowtie-programs/tophat -o -p cpu /path-to-genome-index/prefix fastq file 
For example:
/programs/tophat -o TophatOutput/ -p 8 /programs/indexes/hg19 Experiment1.fastq
Paired-end Example:
/programs/tophat -o TophatOutputPE/ -p 8 /programs/indexes/hg19 Experiment1.r1.fastq Experiment1.r2.fastq
可以發(fā)現(xiàn)，其很多參數(shù)是同bowtie是一樣的。但是它有幾個重要參數(shù)需要了解：
--library-type
 用于生成RNA-seq的library。最常見的是使用fr-unstranded，兩條鏈都考慮。
-G   用于加注transcriptome信息。

五、Bowtie 2對example文件夾中Lambda的處理

1,對lambda_virus.fa建立索引值

cd /sam/bowtie2/example/myindex
 /sam/bowtie2/bowtie2-build /sam/bowtie2/example/reference/lambda_virus.fa lambda_virus
#將會生成以lambda_virus開始名字，后綴為`.1.bt2`, `.2.bt2`, `.3.bt2`, `.4.bt2`,
`.rev.1.bt2`, and `.rev.2.bt2`. 的六個文件；bowtie2-build 可以處理來自[UCSC], [NCBI],[Ensembl]的fasta文件，當處理多個fasta文件的時候，可以用逗號分開處理

2.1 針對unpaired reads的比對

/sam/bowtie2/bowtie2 -p cpu -x lambda_virus -U /sam/bowtie2/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam

2.2針對Paired-end reads的比對

（文件的格式通常為e.g. `-1 flyA_1.fq,flyB_1.fq`）
/sam/bowtie2/bowtie2 -p cpu -x lambda_virus -1 /sam/bowtie2/example/reads/reads_1.fq -2 /sam/bowtie2/example/reads/reads_2.fq -S eg2.sam
-p跟cpu的個數(shù)；
-x跟的是建立的索引，不用跟名字后面的后綴；
-1，-2分別表示Paired-end reads；
輸出格式默認為SAM。
可以指定為多種其它格式，比如說BAM（SAM的二進制文件）等等

問題：

這里的reads用的是clean reads，還是raw reads,我覺得應該是clean reads,如果是clean reads 的話，就得先對raw reads進行trim,但是trimmomatic進行trim后生成的可是4個文件（因為Illumina測序出來paired end 就有正反兩個raw reads，trim后就包括了能配對的兩個正反reads,和不能配對的兩個正反reads），這樣的話，我用哪個呢，就用僅僅能配對上的兩個clean reads?,如果這樣的話，我的拼接過程中可是都用了的，要不分開去匹配，但是分開匹配的，最后的結(jié)果又怎么統(tǒng)計呢？
先用bowtie處理paired的，然后再用-u處理unpaired 得到兩個sam,再cat ,然后再用samtools sort后來統(tǒng)計結(jié)果。
我誤以為這個bowtie既可以處理pair的，也可以同時處理unpair的，結(jié)果出現(xiàn)上面的問題。實際上應該是bowtie2處理的 paired reads 在的兩個文件，必須有同樣多的 reads數(shù)，并且都是一一對應的；如果一對不能都比上 會找其中一條來比對上；一個如果不能比對到基因組，那么使用 –no-mixed 參數(shù)，則不會對與之匹配的reads進行比對了?？傊诵乃枷刖褪潜仨毺幚硪粚?，如果一對中有一條未能匹配上，你可以選擇是否保留這一對的結(jié)果，–no-mixed就是你的選擇。

2.3局部比對的例子

用[local alignment] 來比對更長的reads included
 $BT2_HOME/bowtie2 --local -x lambda_virus -U $BT2_HOME/example/reads/longreads.fq -S eg3.sam

問題：這里的的local跟之前的有啥區(qū)別呢？
可以加入-p 12來調(diào)動我的12個cpu,速度會更快
查看生成的eg1.sam文件
head eg1.sam

2.4其他參數(shù)的說明：

-U 后面接的是unpaired reads
 -S 輸出文件，默認的是stdout，在終端顯示，也可以搞個文件來裝輸出的結(jié)果
輸入文件選項
 -q Reads 為FASTQ格式（`.fq` or `.fastq`.），此為默認的格式
 --qseq Reads 為QSEQ文件（end in `_qseq.txt`）. 
 -f Reads 為FASTA文件（`.fa`, `.fasta`, `.mfa`, `.fna` or similar），如果設定了`-f`,結(jié)果相當于`--ignore-quals`也被設定，就是不衡量質(zhì)量了
 -r Reads為每行就是一條序列，沒有read的名字，沒有質(zhì)量，出來的結(jié)果也相當于`--ignore-quals被設置了
 -c read 序列通過命令行輸入，包含`--ignore-quals`.
 -s/--skip 跳過前面的多少個堿基再來比對
 -u/--qupto 僅僅比對前面的幾個堿基，然后停止比對
 -5/--trim5 在比對之前去掉5’端的幾個堿基（默認的為0）
 -3/--trim3 同理同上
 --phred33 輸入文件的質(zhì)量為33
 --phred64 同理同上，在我之前的博客中有記錄http://blog.sina.com.cn/s/blog_670445240101kq45.html

Bowtie提供了兩個參數(shù)（–phred33和–phred64）來指定計分系統(tǒng)，默認是前者。而且，bowtie會根據(jù)輸入的具體數(shù)據(jù)來識別輸入數(shù)據(jù)實際采用哪套計分系統(tǒng)，用戶不必指定。
針對Phred+33計分系統(tǒng)
!-% 33-37 罰分為0。
&-/ 38-47 罰分為10。
0-9 48-57 罰分為20。
:-I-~ 58-73-126罰分為30。Phred+33實際分數(shù)最高到73
針對Phred+64計分系統(tǒng)
!-% 64-68 罰分為0。
&-/ 69-78 罰分為10。
0-9 79-88 罰分為20。
:-I-~ 89-104-126罰分為30。Phred+64實際分數(shù)最高到104

--solexa-quals 默認的是關(guān)閉的，不解釋
 --int-quals
`--end-to-end` 模式所涉及的幾個參數(shù)
 --very-fast Same as: `-D 5 -R 1 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50`
 --fast Same as: `-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,0,2.50`
 --sensitive Same as: `-D 15 -R 2 -L 22 -i S,1,1.15` (default in `--end-to-end` mode)
 --very-sensitive Same as: `-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50`
`--local` 模式下的幾個參數(shù)
 --very-fast-local Same as: `-D 5 -R 1 -N 0 -L 25 -i S,1,2.00`
 --fast-local Same as: `-D 10 -R 2 -N 0 -L 22 -i S,1,1.75`
 --sensitive-local Same as: `-D 15 -R 2 -N 0 -L 20 -i S,1,0.75` (default in `--local` mode)
 --very-sensitive-local Same as: `-D 20 -R 3 -N 0 -L 20 -i S,1,0.50`

比對的結(jié)果參數(shù)：

-N 在種子比對的過程中容許的錯配數(shù)，一般可以設置為0或者1，設的越高，越慢，但是可以增加比對的靈敏性，默認的為0
-L 設置的種子字串的長度，越小，越靈敏，但是越慢，默認的參數(shù)設置參考上面的。
-i 怎么設置種子，詳見官網(wǎng)說明書
……
其他的參數(shù)具體看官網(wǎng)說明書

六、使用SAMtools/BCFtools來接下來分析

SAMtoolsis是分析SAM和BAM文件的工具
BCFtools分析突變和操作VCF和BCF文件的工具
例子：
1，先用bowtie2生成sam文件
$BT2_HOME/bowtie2 -x $BT2_HOME/example/index/lambda_virus -1 $BT2_HOME/example/reads/reads_1.fq -2 $BT2_HOME/example/reads/reads_2.fq -S eg2.sam
-x 表示建立的索引的前綴名字 -1 -2 后面分別的是雙末端測序的reads –S為輸出的結(jié)果
2，samtools 將SAM文件轉(zhuǎn)化為BAM文件
samtools view -bS eg2.sam > eg2.bam
3，用samtools sort將BAM文件進行排序。
samtools sort eg2.bam eg2.sorted
4，尋找突變通過VCF格式
samtools mpileup -uf $BT2_HOME/example/reference/lambda_virus.fa eg2.sorted.bam | bcftools view -bvcg – > eg2.raw.bcf
5，看突變位點
bcftools view eg2.raw.bcf

七、討論

如何讓bowtie快起來：
如果bowtie在你的機器上運行起來很慢，那么你可以試試以下的一些辦法來讓它跑得快一些：
1，盡可能的使用64位bowtie。很顯然，64位運算會比32位運算更快。所以最好使用支持64位運算的計算機來運行64位的bowtie。如果你是從原文件開始編譯程序，在g++編譯時，你需要傳遞-m64參數(shù)，你也可以在make的時候加入這一信息，比如說傳遞BITS=64給make，具體的：make BITS=64 bowtie。想知道你自己運算的是什么版本的bowtie，你可以運行bowtie –version
2，如果你的計算機有多個CPU或者CPU內(nèi)核，那么請使用-p參數(shù)。-p參數(shù)會讓bowtie進入多線程模式。每一個線程都會使用單獨的CPU或者CPU內(nèi)核。這種并行的運算模式也會大大加快運算速度。
3，如果你的報告文件中每條短序列都有太多的匹配位點（超過10）那么你可以試著重新使用bowtie-build加上 –offrate參數(shù)，如bowtie-build –offrate 4。-o/–offrate默認值為5，每下降1，比對速度會增加1倍，但是系統(tǒng)消耗（硬盤空間和內(nèi)存）也會加倍。如果你的系統(tǒng) 配置太低，比如內(nèi)存不足4GB，那么建議你在bowtie的時候使用–offrate參數(shù)。與上一條相反的，你需要加大offrate的值。bowtie –offrate 6. 其默認值為5。每增加1，內(nèi)存空間的要求下降，這樣會減少讀取硬盤當?%AL??擬內(nèi)存的次數(shù)，速度反而會有所上升。
4，-n模式與-v模式。
默認的，bowtie采用了和Maq一樣的質(zhì)量控制策略，設置-n 2 -l 28 -e 70?？偟膩碚f，比對模式分為兩種，一種是 -n 模式， 一種是 -v 模式，而且這兩種模式是不能同時使用的。bowtie默認使用-n模式。
-n模式參數(shù)： -n N -l L -e E
其中Ｎ，Ｌ，Ｅ都為整數(shù)。-n N 代表在高保真區(qū)內(nèi)錯配不能超過Ｎ個，可以是0?3，一般的設置為2。-l L代表序列高保真區(qū)的長度，最短不能少于5，對于短序列長度為32的，設置為28就很不錯。-e E代表在錯配位點Phred quality值不能超過E，默認值為40。Phred quality值的計算式為：-10 log(P,base(10))
Phred Quality值 錯配可能性 正配可能性
10 1/10 90％
20 1/100 99％
30 1/1000 99.9％
40 1/10000 99.99%
50 1/100000 99.999%
而-v模式的參數(shù)相對較少。
-v模式參數(shù)：-v V
其中V為整數(shù)。-v V代表全長錯配不能超過Ｖ個，可以是0?3。這時，不考慮是否高保真區(qū)，也不考慮Phred quality值。
5，–best 與–strata
–best 參數(shù)代表報告文件中，每個短序列的匹配結(jié)果將按匹配質(zhì)量由高到低排序。–strata參數(shù)必須與–best參數(shù)一起使用，其作用是只報告質(zhì)量最高的那部 分。所謂質(zhì)量高低，其實就是指錯配的堿基數(shù)，如果指定了-l L參數(shù)，那就是在高保真區(qū)內(nèi)的錯配數(shù)，否則就是全序列的錯配數(shù)。如果你還指定了 -M X的話，那就會在質(zhì)量最高的當中，隨機選擇X個來報告。也就是說，當我們指定了-M 1 –best –strata的話，那就只報告1個最好的。
對于輸入，-q是指輸入的文件為FASTQ(文件擴展名通常為.fq或者.fastq)格式；-f是指輸入文件為FASTA(文件擴展名通常為.fa, .mfa或者.fna)格式；-c是指在命令行直接輸入要比對的序列。

參考資料：
官方使用說明手冊 http://computing.bio./local/doc/bowtie2.html
bowtie:短序列比對的新工具http://blog.sina.com.cn/s/blog_5ecfd9d90100ukqq.html
Lemon的博客：http://blog.163.com/zhoulili1987619@126/blog/static/3530820120137132216950/

附：
[Bowtie 2] is often the first step in pipelines for comparative genomics,including for variation calling, ChIP-seq, RNA-seq, BS-seq. [Bowtie 2] and [Bowtie] (also called “[Bowtie 1]” here) are also tightly integrated into some
tools, including [TopHat]: a fast splice junction mapper for RNA-seq reads,[Cufflinks]: a tool for transcriptome assembly and isoform quantitiation from RNA-seq reads, [Crossbow]: a cloud-enabled software tool for analyzing

reseuqncing data, and [Myrna]: a cloud-enabled software tool for aligning RNA-seq reads and measuring differential gene expression.

原文鏈接：https://www.baidu.com/s?wd=bowtie%E5%92%8Cbowtie2&rsv_spt=1&rsv_iqid=0xc3dbb58f00010a1d&issp=1&f=8&rsv_bp=0&rsv_idx=2&ie=utf-8&tn=baiduhome_pg&rsv_enter=1&rsv_sug3=2&rsv_sug1=2&rsv_sug7=101&rsv_t=0c88kw3SdPguWwJtYtx5FA1u9M47Gv9w33Ij6k0QzUUP6ML%2BkcnA5l9u5gBpd3xRwlgR