上一期的推送中我們簡要介紹了一篇發(fā)表在《Neuropsychopharmacology 》上的精神分裂癥環(huán)狀RNA研究，文章通過對來自DLPFC腦區(qū)的轉錄組測序數(shù)據(jù)進行分析，揭示了精神分裂癥相關環(huán)狀RNA的表達圖譜。接著上期的內容，我們來繼續(xù)探討文章后半部分更為高級的生信分析內容。

環(huán)狀RNA的表達變化是否與宿主基因相關聯(lián)？

為了回答這個問題，研究人員通過Total RNA建庫的數(shù)據(jù)將環(huán)狀RNA表達相對變化與其宿主基因表達的相對變化進行比較。他們發(fā)現(xiàn)盡管只有半數(shù)的差異環(huán)狀RNA的宿主基因體現(xiàn)出相同的變化趨勢（如下圖A)，但環(huán)狀RNA表達下調與對應宿主基因的表達差異具有微弱的相關性（P=0.022，如下圖A）。但是這種相關性在全部環(huán)狀RNA集合中便不再存在了（如下圖B）。說明環(huán)狀RNA在精神分裂癥中的表達差異與其宿主基因具有一定微弱的關系。

作者進一步研究表達差異的基因是否轉錄出表達差異的環(huán)狀RNA，或者表達差異的環(huán)狀RNA是否來自與表達差異的基因。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)798個差異的線性轉錄本中，僅有37個可以轉錄出環(huán)狀RNA，其中僅有1個是差異表達的。

你們想要的網絡圖——ceRNA分析

環(huán)狀RNA分析的文章怎么能缺少circRNA-miRNA-mRNA的互作網絡圖呢？套路大家懂的，從差異的環(huán)狀RNA中篩選miRNA靶點，然后再用miRNA去尋找差異的mRNA。該步分析的核心在于靶點預測軟件的選區(qū)和結合位點閾值的設定，該文章選用TargetScan，閾值設置為context score cutoff < -0.4。通過篩選，574個差異環(huán)狀RNA靶向241個miRNA，進而連接306個差異基因（如圖A）。為了進一步減少網絡中的分子數(shù)目，作者限定差異表達的環(huán)狀RNA必須排在前45位，重復同樣的分析得到99個miRNA和224個差異表達mRNA（如圖B）。由于精神分裂癥中已有miRNA的研究報道，作者在網絡中將這些miRNA及其連接的分子挑選出來組成了新的網絡（如圖C）。

來點不一樣的——環(huán)狀RNA可變剪切分析

考慮到大腦DLPFC的環(huán)狀RNA表達的豐富程度，研究人員假設這些環(huán)狀RNA的形成可能會伴隨著不同程度的可變剪切存在。在技術上，CIRCexplorer2程序擴展后具有基因組組裝能力，借助Cufflinks以及注釋信息，能夠幫助科研人員鑒定環(huán)狀RNA的可變剪切事件。

利用RNase-enriched的數(shù)據(jù)集，研究人員在全部樣本中發(fā)現(xiàn)約有35%~76%的back-splicing位點存在可變剪切現(xiàn)象，細分后發(fā)現(xiàn)精分患者組的可變剪切比例稍低于正常對照（如下圖A）。為了更加精確地度量可變剪切事件，作者分別采用四種計算方式：Percent Splicesite Usage (PSU) for alternative 5′/3′ splice site selection, Percent Spliced In (PSI) for cassette exon selection and Percent Intron Retention (PIR) for intron retention 對四種不同的可變剪切事件進行度量。如下圖B-E，精神分裂癥患者中環(huán)狀RNA可變剪切水平明顯低于對照組，且這種趨勢并不是由于測序量差異導致的偏差（如下圖F）。

一點總結

這篇文章在2019年開年憑借幾乎純生物信息分析發(fā)表在老牌雜志《Neuropsychopharmacology 》上自有它的可貴之處。細讀下來，全文雖然大部分分析內容比較常規(guī)，但行文邏輯以及結果闡述都非常清晰明了。作者在差異分析中不是急于挑選一個候選分子進行下游的生物學驗證，而是將觀察到的病理組的整體表達下調這一趨勢深入研究下去，并且分析了較為復雜的可變剪切事件。作為精神分裂癥領域第一篇環(huán)狀RNA研究的文章，作者在曝譜的同時將故事講得如此生動還是值得我們學習的。

轉自生信草堂公眾號，已授權

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