RNA甲基化近來很受高分期刊的親睞，讓我們一起看看近日中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝課題組在Nature Communications雜志發(fā)表的文章RNA m⁶A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail的研究思路。文章主要發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞上皮間質(zhì)化（EMT）過程中mRNA的m⁶A顯著上調(diào)，其可通過促進EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的翻譯從而促進腫瘤EMT及侵襲轉(zhuǎn)移。文中圖片及數(shù)據(jù)均來源于Lin X, Chai G, Wu Y, et al. RNA m6A methylation regulates the epithelial mesenchymal transition of cancer cells and translation of Snail. Nat Commun. 2019;10(1):2065. Published 2019 May 6. doi:10.1038/s41467-019-09865-9.

（篇幅較長，耐心讀，一定受益匪淺）

文章的主要內(nèi)容為：與對照細胞相比，在腫瘤細胞EMT過程中，mRNAs的m⁶A修飾增加。敲低甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達或過表達ALKBH5可以抑制癌細胞遷移、侵襲和EMT。m⁶A-seq和功能實驗顯示，Snail的表達受m6A動態(tài)調(diào)節(jié)，并且過表達Snail能逆轉(zhuǎn)METTL3缺失導(dǎo)致的細胞EMT抑制。另外，Snail mRNA的CDS區(qū)而非3’UTR區(qū)的m⁶A修飾。功能研究擺明，Snail的CDS區(qū)域中的m⁶A可以通過與YTHDF1和eEF-2的相互作用而觸發(fā)其翻譯延伸。臨床數(shù)據(jù)顯示，腫瘤組織內(nèi)含有與癌旁組織相比， METTL3和YTHDF1的表達量更高，這導(dǎo)致肝癌患者的預(yù)后更差。

研究目的與意義：1974年首次發(fā)現(xiàn)m⁶A甲基化，它是一種RNA分子上的甲基化修飾，m⁶A修飾在哺乳動物細胞中是動態(tài)可逆的，類似于DNA和組蛋白修飾的另一種表觀遺傳調(diào)控，近年來m⁶A甲基化已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。通過諸多學(xué)者辛苦研究，結(jié)果表明在mRNA中發(fā)現(xiàn)的m6A修飾可以調(diào)節(jié)癌細胞的生命活動。另外我們知道EMT是上皮細胞獲得間充質(zhì)細胞特質(zhì)的一種重要現(xiàn)象，通過EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子（例如Snail，Slug，Twist和Zeb）來抑制e-cadheri的表達促進癌細胞的轉(zhuǎn)移，此外，Snail是e-cadherin表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，近年來圍繞EMT的表觀遺傳調(diào)控因素做了諸多研究，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化及組蛋白修飾等均可參與腫瘤細胞EMT的發(fā)生發(fā)展，但mRNA修飾對腫瘤細胞EMT的影響尚未揭示。

研究結(jié)果：

一、癌細胞中EMT受mRNA的甲基化水平調(diào)控

作者從多個角度驗證分析了EMT受mRNA的甲基化水平調(diào)控，雖然EMT可以被各種細胞外配體誘導(dǎo)，但TGF-β被認為是癌細胞轉(zhuǎn)移過程的主要誘導(dǎo)因子。因此作者用10ng / ml TGF-β處理HeLa和HepG2細胞3天，觀察細胞，HeLa和HepG2細胞均分散并呈纖維細胞形態(tài)（下圖A）。 通過細胞刮擦、TGF-β處理以及Transwell檢測發(fā)現(xiàn)HeLa和HepG2細胞的傷口愈合（下圖B），侵襲能力（下圖C）均顯著增加；通過qRT-PCR觀察到FN1和MMP2 mRNA上調(diào)且CDH1（E-Cad）mRNA下調(diào)（下圖D）。 通過蛋白質(zhì)印跡分析進一步證實了這些TGF-β誘導(dǎo)的EMT標志物表達的變化（下圖E）。

以上所有這些數(shù)據(jù)表明用TGF-β處理的癌細胞正在進行EMT過程。

然后，作者研究了經(jīng)歷EMT的癌細胞的mRNA中m⁶A水平的變化。通過LC-MS/MS分析，使用來自同一批次的標準樣品的標準曲線計算定量?；谛是€計算m⁶A與A的比率，發(fā)現(xiàn)通過TGF-β處理， HeLa和HepG2細胞中m⁶A水平的mRNA比對照細胞更豐富。

此外，通過斑點印跡分析獲得的結(jié)果進一步證實了這一點。

 類似地，用TGF-β處理的Huh7和A549細胞得到的結(jié)果與上述結(jié)果一致；

總的來說，這些數(shù)據(jù)顯示經(jīng)歷EMT的癌細胞增加m⁶A水平的mRNA。

為了證明m⁶A在EMT過程中的作用，作者使用CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)，在HeLa細胞中敲低METTL3，形成 METTL3^Mut/? HeLa細胞。下圖是METTL3在野生型及METTL3^Mut/? HeLa細胞中的蛋白表達情況。

進一步通過LC-MS/MS分析，結(jié)果顯示，METTL3 ^Mut/? HeLa 細胞的m⁶A水平顯著低于野生型細胞，這也證實了METTL3作為mRNA的m⁶A具有介導(dǎo)催化作用。

得到這個結(jié)果后，作者對METTL3^Mut/? HeLa 細胞EMT特性進行了評估，依舊使用細胞傷口愈合能力及細胞體外侵襲能力來檢測，結(jié)果顯示：與野生型相比，METTL3^Mut/? HeLa 細胞的傷口愈合能力及體外侵襲能力均受到抑制；

使用同樣的方法，在Huh7和HepG2細胞中出現(xiàn)類似結(jié)果；

此外，作者發(fā)現(xiàn)，在METTL3^Mut/? HeLa細胞中，MMP2和FN在mRNA和蛋白水平下調(diào)，而E-Cad 在mRNA和蛋白水平上調(diào)。E-cadherin（由CDH1基因編碼）的降低被是EMT發(fā)生的基礎(chǔ)。

接著，作者在在Huh7和HepG2細胞中進一步驗證，通過蛋白質(zhì)印跡分析證實，敲低METTL3，可降低MMP2和FN，同時增加了E-Cad。

這些數(shù)據(jù)表明METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發(fā)生；

作者進一步驗證m⁶A水平在EMT中的作用，作者在HeLa細胞中過表達ALKBH5，它是哺乳動物mRNA37的關(guān)鍵m⁶A脫甲基酶。數(shù)據(jù)顯示ALKBH5的過表達降低了HeLa細胞中FN和MMP2的mRNA。

進一步通過蛋白質(zhì)印跡分析顯示ALKBH5的過表達增加了E-Cad，同時降低了HeLa細胞中的MMP2和FN。

此外，在METTL3^Mut/?HeLa和Mett13敲低的Huh7細胞中恢復(fù)了由TGF-β誘導(dǎo)的E-Cad下調(diào)和FN上調(diào)。 

根據(jù)上述數(shù)據(jù)已經(jīng)知道METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發(fā)生，作者進一步研究了METTL3的臨床作用。TCGA數(shù)據(jù)顯示，METTL3在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。

在364名肝癌患者中，METTL3的表達與CDH1 mRNA呈負相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)與上述數(shù)據(jù)呈現(xiàn)結(jié)果一致 。

根據(jù)Bertero等的報道，TGF-β可通過Smad2 / 3與METTL3-METTL14- WTAP復(fù)合物之間的相互作用誘導(dǎo)人胚胎干細胞（hESCs）中的mRNA甲基化。通過使用Smad2 / 3抑制劑B431542（10μM）預(yù)處理HeLa細胞，然后用TGF-β進一步處理3天，通過LC-MS/MS測定總mRNA的m⁶A 與A的比例，來計算m⁶A在mRNA上整體的甲基化程度。發(fā)現(xiàn)Smad2/3抑制劑SB431542（SB）可以阻礙TGF-β誘導(dǎo)的HeLa細胞中m⁶A的上調(diào)。 

根據(jù)以上數(shù)據(jù)，可表明：mRNA中的總m⁶A水平可以促進癌細胞的EMT。

二、EMT的細胞，m6A會調(diào)控其它基因的變化

為了研究在m⁶A修飾在特定基因中的變化，作者通過m⁶A測序，定位了進行EMT的HeLa細胞的m⁶A甲基化組，發(fā)現(xiàn)：GGAC motif在對照和EMT細胞中的m⁶A位點內(nèi)高度富集，另外，m⁶A的峰主要出現(xiàn)在起始密碼子和終止密碼子附近。

作者利用m⁶A-seq結(jié)果進一步分析了mRNA的總m⁶A分布情況。 觀察到對照和EMT細胞中總m⁶A分布的類似， m⁶A峰主要富集外顯子區(qū)域；

接著作者將對照與EMT細胞進行比較，共鑒定了128個基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表達水平上，EMT細胞的m⁶A是對照的1.5倍。 這128個基因GO富集分析表明，少數(shù)基因與經(jīng)歷EMT的癌細胞中的黏附連接以及肌動蛋白細胞骨架的形成有關(guān)。

總的來說，m⁶A-seq數(shù)據(jù)顯示m6A修飾發(fā)生在EMT期間與細胞連接，粘附和遷移相關(guān)的少數(shù)基因上。

三、Sainl參與癌細胞中m6A水平調(diào)節(jié)EMT

為了驗證Sainl是參與m⁶A調(diào)節(jié)的癌細胞EMT的潛在靶點，作者通過在EMT期間鑒定84個EMT的相關(guān)基因和61 個m⁶A調(diào)節(jié)基因（大于2倍m6A變化），最終確定了四個重疊基因。分別為SANI1、CTGF、MSN、CTNNB1，在四種鑒定的基因中，Snail被認為是控制EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子。作者的數(shù)據(jù)證實Sainl mRNA被m⁶A修飾，并且在EMT進展期間在CDS和3'UTR區(qū)域中m⁶A的顯著富集，另外，作者通過RIP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在EMT細胞中，m⁶A水平的Sainl-mRNA顯著增加，富集倍數(shù)與對照相比約為2.3倍。

接下來，作者研究了在HeLa細胞中敲低METTL3、以及過表達ALKBH5時Snail蛋白的表達情況，。在METTL3缺失和ALKBH5過表達的兩種情況下，作者觀察到HeLa和HepG2細胞中Snail蛋白水平的降低而ZEB1表達沒有變化。

為了證實m⁶A對Snail表達有作用，作者用TGF-β處理野生型和METTL3^{Mut /-}HeLa細胞。結(jié)果顯示，在METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中，TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達低于對照細胞，這表明m⁶A參與TGF-β誘導(dǎo)的癌細胞中Snail的表達。

作者進一步研究了Snail在m⁶A觸發(fā)的癌細胞EMT中的作用，Snail的過表達，會使HeLa細胞中由于METTL3缺失而減弱傷口愈合受到抑制。

同樣的，METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中，Snail的過表達抑制了FN的下調(diào)和E-Cad的上調(diào)。

這些數(shù)據(jù)表明，Snail參與癌細胞中m⁶A調(diào)節(jié)的EMT。

四、m6A促進癌細胞中Snail mRNA的翻譯

作者進一步研究m⁶A甲基化調(diào)節(jié)Snail表達的機制。首先，作者檢測了Snail的pre-mRNA和mat-mRNA的表達。令人驚訝的是，在敲低METTL3的細胞中Snail的pre-mRNA和mat-mRNA的表達都顯著增強。然而，野生型和敲低METTL3的細胞中的啟動子活性沒有差異，表明Snail的轉(zhuǎn)錄不受m6A的影響。

接著作者通過分離細胞核和細胞質(zhì)的RNA，發(fā)現(xiàn)野生型和敲低METTL3的細胞之間Snail mRNA的亞細胞定位沒有差異。

用Act-D處理野生型和METTL3^{Mut /-}HeLa細胞以阻斷轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示野生型細胞中pre-mRNA和mat-mRNA的半衰期顯著短于METTL3^{Mut /-}HeLa 細胞。表明m⁶A修飾可能引發(fā)pre-mRNA的剪切和癌細胞中Snail mat-mRNA的降解。

另外作者補充證實，Snail是YTHDF2的靶標，其負責(zé)m⁶A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物的mRNA去穩(wěn)定化。過量表達YTHDF2可降低HeLa細胞中成熟Snail mRNA的表達和穩(wěn)定性；

然后，假設(shè)METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中Snail蛋白的下調(diào)可能是由于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性或翻譯效率引起的。為了證實這一點，用蛋白翻譯抑制劑CHX處理野生型和METTL3^{Mut /-}HeLa細胞。 通過Wester-blot印跡分析的結(jié)果顯示，野生型和METTL3^{Mut /-}HeLa細胞之間Snail蛋白的半衰期相似；

這表明m⁶A誘導(dǎo)的Snail表達與蛋白穩(wěn)定性無關(guān)。

此外，作者用MG132預(yù)處理METTL3^{Mut /-}HeLa細胞以抑制蛋白體外酶活性和使用CHX阻斷蛋白翻譯，然后用TGF-β處理。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，在CHX而非MG132存在下， TGF-β誘導(dǎo)的METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中的Snail表達減弱。

隨后作者將Snail CDS連接到多克隆位點（MCS）構(gòu)建了pmirGLO-Snail熒光素酶報告基因。 雙熒光素酶測定顯示，Snail在METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中的翻譯效率顯著低于野生型細胞。

表明m⁶A誘導(dǎo)的Snail表達與翻譯調(diào)控有關(guān)。

下面作者對RNA進行分類，通過多聚核糖體分析，發(fā)現(xiàn)METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中80S的核糖單體和多聚核糖體都低于野生型細胞。

另外，qRT-PCR顯示：METTL3^{Mut /-}HeLa細胞中轉(zhuǎn)錄活躍的多核糖體（> 80S）中的Snail mRNA顯著低于野生型細胞。  

作者在EMT細胞與野生型細胞中進行多聚核糖體分析，發(fā)現(xiàn)二者相似。 值得注意的是， EMT的癌細胞的多聚核糖體（> 80S）中SNAI1 mRNA增加；

表明在EMT過程促進SNAI1 mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯。

五、SNAI1 CDS區(qū)域中的m⁶A是表達調(diào)控的主要位置

作者通過對m⁶A-RIP測序，數(shù)據(jù)顯示CDS區(qū)域中m⁶A峰值位于第20條染色體上，48,600,490 to 48,600,630且在3 'UTR。

作者鑒定了3個GGAC motif，分別位于CDS區(qū)域和Snail mRNA的3'UTR區(qū)域；

這個結(jié)果與m⁶A RIP-seq鑒定的峰的位置和量是一致的。然后通過免疫沉淀法收集片段化RNA進一步驗證，發(fā)現(xiàn)CDS區(qū)域中的m6A甲基化可能比3'UTR中的m⁶A甲基化更具動態(tài)；

下面作者對m⁶A甲基化對SNAI13'UTR及CDS區(qū)域分別作了詳細研究。

首先，作者為了研究m⁶A甲基化對SNAI1 3'UTR區(qū)的潛在作用，作者再次構(gòu)建熒光素酶報告基因，分別為：WT-3’UTR、MUT1-3’UTR、MUT2-3’UTR。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照細胞的翻譯沒有差異。

這表明3'UTR上的m⁶A甲基化可能不參與m6A修飾調(diào)節(jié)的Snail表達；

然后作者研究了CDS區(qū)域的m6A甲基化是否可以調(diào)節(jié)Snail的表達。首先，生成一個僅包含Snail CDS的表達式構(gòu)建體。與pcDNA / ZEB1共轉(zhuǎn)染Snail CDS，其表達不受m⁶A甲基化調(diào)節(jié)，以保證轉(zhuǎn)染效率正常。結(jié)果顯示，METTL3^Mut細胞中Snail的表達顯著降低，而ZEB1的表達未受影響，表明CDS中的m⁶A甲基化與m⁶A介導(dǎo)的Snail表達密切相關(guān)。其次，作者將m⁶A的GGAC motif突變?yōu)镚GCC（CDS-mut1）。將附近的GGAA突變?yōu)镚GCA用于比較（CDS- mut2）。

數(shù)據(jù)顯示，在過量表達pcDNA-Snail-CDS-mut1的METTL3^Mut細胞中部分上調(diào)了Snail表達水平（上圖）。將pcDNA-Snail-CDS-WT、pcDNA-Snail CDS-mut1 / mut2轉(zhuǎn)染的HeLa細胞進行TGF-β處理。 蛋白印跡結(jié)果顯示，TGF-β誘導(dǎo)的pcDNA Snail-CDS-mut1的Snail表達低于pcDNA-Snail-CDS-WT和pcDNA-Snail-CDS-mut2（下圖）。

總之，結(jié)果數(shù)據(jù)表明SNAI1 CDS區(qū)域中的m⁶A是表達調(diào)控的主要位置；

我們知道，YTHDF1作為RNA甲基化的讀取器，具有識別m⁶A  mRNA的功能。作者對YTHDF1是否參與SNAI1 mRNA的m⁶A甲基化進行了驗證。利用RIP-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)YTHDF1顯著富含SNAI1 mRNA，而這種相對富集在METTL3^Mut 細胞中被抑制。并且YTHDF1主要與SNAI1 的CDS區(qū)域相互作用；

為了進一步驗證這個結(jié)果，作者在HeLa細胞中敲低了YTHDF1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HeLa細胞中由TGF-β誘導(dǎo)的Snail表達也降低了;

由于真核生物的翻譯延伸是由兩個延伸因子作用進行的，：eEF-1和eEF-2，作者觀察了MetE13^{Mut -}HeLa細胞中eEF-1和eEF-2結(jié)合Snail mRNA的變異。數(shù)據(jù)顯示，在METTL3^Mut-HeLa細胞中Snail mRNA和eEF-2之間的結(jié)合顯著低于HeLa細胞中的結(jié)合。 此外，通過蛋白定性分析表明，得到了類似的結(jié)果。 

這些數(shù)據(jù)統(tǒng)一表明YTHDF1和eEF-2可能是m⁶A誘導(dǎo)的癌細胞中Snail mRNA翻譯延伸的因素。

六、m⁶A與癌細胞發(fā)展有關(guān)

作者用了三個動物群組來研究m⁶A甲基化對癌細胞轉(zhuǎn)移的潛在影響。 首先，將sh-control和sh-METTL3 Huh7細胞皮下注射到裸雌性小鼠中。 當(dāng)腫瘤體積為每組約100mm ³時，殺死小鼠。 IHC結(jié)果顯示，METTL3的降低，導(dǎo)致異種移植腫瘤組織中Snail，F(xiàn)N和Vim的表達水平下降，這表明當(dāng)腫瘤體積約100mm³時，METTL3的敲低可降低Huh7細胞的EMT和Snail表達。 

為了進一步確定m⁶A甲基化對體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，分別對BALB/c裸鼠進行尾靜脈注射。注射后8周，對轉(zhuǎn)移性腫瘤進行分析。與對照細胞相比，來自sh-METTL3 Huh7細胞的肺腫瘤的數(shù)量顯著減少，表明METTL3的下調(diào)可抑制體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移。

進一步研究Snail是否參與m⁶A調(diào)節(jié)的體內(nèi)轉(zhuǎn)移，將HeLa WT，METTL3^{Mut /-} HeLa，HeLa^Snail和Mettl-^{Mut /-} HeLa^Snail細胞尾靜脈注射到裸鼠中。體內(nèi)數(shù)據(jù)顯示，與HeLa WT細胞相比，源自METTL3^{Mut /-} HeLa細胞的肺腫瘤數(shù)量顯著減少；然而，過量表達Snail會減弱METTL3^{Mut /-} HeLa細胞對體內(nèi)轉(zhuǎn)移性腫瘤的抑制作用；

這表明Snail參與了METTL3的體內(nèi)轉(zhuǎn)移作用。

目前數(shù)據(jù)已經(jīng)可以證明敲低METTL3，可以降低Snail的表達，以及HepG2 和 Huh7 細胞的體外侵襲和EMT，然后作者研究了m⁶A與臨床開發(fā)有何聯(lián)系？肝癌組織與癌旁組織相比，在肝癌組織中METTL3和YTHDF1的表達上調(diào)；且肝癌腫瘤組織的T1至T4期，YTHDF1表達水平顯著升高；

此外，YTHDF1的表達與肝癌癌癥患者中的SNAI1 mRNA正相關(guān)。另外觀察到METTL3從正常肝臟到肝硬化再到肝癌組織中表達水平持續(xù)上升。

作者使用組織微陣列檢查了100例肝癌組織中的蛋白質(zhì)表達。IHC分析證實，在測量的100個肝癌中，METTL3的表達與Snail的表達正相關(guān)。

最終，作者證實METTL3、YTHDF1、Snail表達增加的肝癌患者，總體存活率降低。