 1 全外顯子組測(cè)序必須要有參考基因組嗎？ 必須有，如果沒有參考因組，要提供近緣物種的序列，但不能保證捕獲結(jié)果的可靠性。因?yàn)椴东@探針是根據(jù)提供的參考序列來(lái)設(shè)計(jì)的，如果已知目標(biāo)區(qū)域與參考基因組比有較大出入，例如大片段的插入缺失，是不推薦的。 2 為什么外顯子測(cè)序在分析時(shí)需要跟全基因組比對(duì)，而不是直接與目標(biāo)區(qū)域比對(duì)？ 第一，目標(biāo)區(qū)域相對(duì)于全基因組一般較短，而且可能不連續(xù)，如果將目標(biāo)區(qū)域單獨(dú)提取出來(lái)，會(huì)影響區(qū)域邊緣的序列比對(duì)效果； 第二，無(wú)法評(píng)估捕獲質(zhì)量，例如脫靶率、on target比例等。 3 全外顯子組測(cè)序一般建議做多少倍的覆蓋？ 一般做100×或150×。較高的覆蓋倍數(shù)，對(duì)于測(cè)異質(zhì)性的遺傳變質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)小比例的突變。另外，外顯子測(cè)序的覆蓋是隨機(jī)的，這樣較高的平均覆蓋率有利于保證大部分的區(qū)域有足夠的覆蓋倍數(shù)。 4 全外顯子組測(cè)序深度的意義是什么？測(cè)序深度如何換算？ 測(cè)序深度代表了序列被探針組覆蓋的次數(shù)，次數(shù)越高，測(cè)序結(jié)果的識(shí)別就越精確，后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析也就越準(zhǔn)確。如果做腫瘤、低頻突變研究，建議測(cè)序深度至少應(yīng)達(dá)到150×以上。如果只看經(jīng)典SNP、非低頻突變，測(cè)序深度也至少應(yīng)該在30×以上。測(cè)序深度換算方法：一般目標(biāo)區(qū)域的捕獲效率在60-70%，安捷倫和羅氏等外顯子捕獲試劑盒的目標(biāo)區(qū)域大小在60Mb左右，即測(cè)序深度=10G*60%/60Mb=100×。 5 全外顯子組測(cè)序能夠測(cè)出多大的片段缺失？ 大致能測(cè)出50bp的片段缺失。由于外顯子測(cè)序的覆蓋很不平均，所以如果有大段的缺失，無(wú)法判斷是因?yàn)殡s交沒有捕獲到，還是因?yàn)槿笔АＤ壳澳軌驕y(cè)到的，就是在一個(gè)read中發(fā)現(xiàn)的缺失。一個(gè)read的長(zhǎng)度也就是150bp，所以50bp以下的片段缺失可以從外顯子測(cè)序中測(cè)出來(lái)。 6 全外顯子組測(cè)序可以做CNV分析嗎？檢測(cè)CNV的方法還有哪些？ 全外顯子測(cè)序因?yàn)橛幸粋€(gè)雜交捕獲的過程，這樣就會(huì)有一個(gè)雜交捕獲效率的問題。各個(gè)外顯子的雜交效率是不同的，其同源競(jìng)爭(zhēng)的情況也不同，所以不同的外顯子的覆蓋率的差異就很大。所以一般情況下，外顯子測(cè)序不能用于CNV的檢測(cè)。但在癌癥研究中，利用癌組織和癌旁組織對(duì)照，可以檢測(cè)CNV。還有另外兩種常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)CNV，一種是全基因組重測(cè)序，另外一種是用Affymetrix SNP6.0的芯片來(lái)測(cè)。其中Affymetrix SNP6.0的檢測(cè)費(fèi)用較低，是一個(gè)相對(duì)經(jīng)濟(jì)的手段。 7 全外顯子組測(cè)序能否進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域甲基化檢測(cè)？可以進(jìn)行RNA捕獲嗎？ 目標(biāo)區(qū)域甲基化檢測(cè)可以直接使用甲基化捕獲測(cè)序產(chǎn)品，例如SureSelect的MethylSeq或者NimbleGen的SeqCap Epi，都能進(jìn)行甲基化捕獲，原理和捕獲測(cè)序類似，利用特制的探針對(duì)研究者感興趣的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲富集，經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后進(jìn)行測(cè)序和甲基化檢測(cè)。RNA捕獲可以使用SureSelect的RNA Capture或者NimbleGen的SeqCapRNA System產(chǎn)品。 8 能否捕獲多物種混合的樣品？ 可以，只要捕獲的目的片段有相應(yīng)的參考基因組，就能夠被探針捕獲到。例如宿主基因組中整合的病毒序列、血液中混合的寄生蟲序列、環(huán)境樣品中的低豐度微生物序列等等。由于這些序列在混樣中所占的比例往往很低，使用傳統(tǒng)的重測(cè)序方法的效率會(huì)非常低，需要非常高的測(cè)序量才能得到足夠的覆蓋深度，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的冗余數(shù)據(jù)。捕獲測(cè)序在這方面具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。 9 捕獲的效果有沒有指標(biāo)？什么因素會(huì)降低捕獲效果？ 由于測(cè)序技術(shù)的限制，會(huì)有部分重復(fù)序列、未確定的“N堿基”、樣本本身質(zhì)量等因素導(dǎo)致序列有無(wú)法覆蓋到的可能性，這是所有測(cè)序技術(shù)都會(huì)遇到的問題，即使是全基因組深度測(cè)序，也無(wú)法保證100%完全覆蓋基因組。由于每位老師的樣品千差萬(wàn)別，對(duì)捕獲的效果直接做出承諾并不靠譜。最好的方式是：老師提供給我們目標(biāo)區(qū)域，由歐易技術(shù)人員設(shè)計(jì)評(píng)估一下，就能得出預(yù)期的覆蓋度、可能無(wú)法覆蓋的區(qū)域等詳細(xì)報(bào)告。此外，物種普遍存在重復(fù)序列的情況，在設(shè)計(jì)前一般會(huì)先屏蔽掉一些難以覆蓋的重復(fù)區(qū)域（mask）再進(jìn)行設(shè)計(jì)，會(huì)提高捕獲質(zhì)量，但同時(shí)會(huì)降低總體的覆蓋度。 10 高GC 含量的片段能否捕獲? 可以，但對(duì)這些片段的捕獲效率會(huì)有一定影響。同樣地，低復(fù)雜度片段和含有模糊堿基片段也有一定的捕獲難度。歐易技術(shù)人員在設(shè)計(jì)探針時(shí)會(huì)根據(jù)覆蓋度情況適當(dāng)增加覆蓋次數(shù)和探針密度等，并且將預(yù)期的捕獲效果（能夠捕獲到的片段、無(wú)法捕獲到的片段）發(fā)給客戶確認(rèn)。另外，如果是捕獲全外顯子、UTR 等，可以選用預(yù)設(shè)探針組，這些探針設(shè)計(jì)對(duì)較難捕獲的片段進(jìn)行了優(yōu)化，提高了相應(yīng)的捕獲效率。 |
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