上一期的推送中我們簡(jiǎn)要介紹了一篇發(fā)表在《Neuropsychopharmacology 》上的精神分裂癥環(huán)狀RNA研究，文章通過對(duì)來自DLPFC腦區(qū)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，揭示了精神分裂癥相關(guān)環(huán)狀RNA的表達(dá)圖譜。接著上期的內(nèi)容，我們來繼續(xù)探討文章后半部分更為高級(jí)的生信分析內(nèi)容。

環(huán)狀RNA的表達(dá)變化是否與宿主基因相關(guān)聯(lián)？

為了回答這個(gè)問題，研究人員通過Total RNA建庫的數(shù)據(jù)將環(huán)狀RNA表達(dá)相對(duì)變化與其宿主基因表達(dá)的相對(duì)變化進(jìn)行比較。他們發(fā)現(xiàn)盡管只有半數(shù)的差異環(huán)狀RNA的宿主基因體現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)（如下圖A)，但環(huán)狀RNA表達(dá)下調(diào)與對(duì)應(yīng)宿主基因的表達(dá)差異具有微弱的相關(guān)性（P=0.022，如下圖A）。但是這種相關(guān)性在全部環(huán)狀RNA集合中便不再存在了（如下圖B）。說明環(huán)狀RNA在精神分裂癥中的表達(dá)差異與其宿主基因具有一定微弱的關(guān)系。

作者進(jìn)一步研究表達(dá)差異的基因是否轉(zhuǎn)錄出表達(dá)差異的環(huán)狀RNA，或者表達(dá)差異的環(huán)狀RNA是否來自與表達(dá)差異的基因。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)798個(gè)差異的線性轉(zhuǎn)錄本中，僅有37個(gè)可以轉(zhuǎn)錄出環(huán)狀RNA，其中僅有1個(gè)是差異表達(dá)的。

你們想要的網(wǎng)絡(luò)圖——ceRNA分析

環(huán)狀RNA分析的文章怎么能缺少circRNA-miRNA-mRNA的互作網(wǎng)絡(luò)圖呢？套路大家懂的，從差異的環(huán)狀RNA中篩選miRNA靶點(diǎn)，然后再用miRNA去尋找差異的mRNA。該步分析的核心在于靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件的選區(qū)和結(jié)合位點(diǎn)閾值的設(shè)定，該文章選用TargetScan，閾值設(shè)置為context score cutoff < -0.4。通過篩選，574個(gè)差異環(huán)狀RNA靶向241個(gè)miRNA，進(jìn)而連接306個(gè)差異基因（如圖A）。為了進(jìn)一步減少網(wǎng)絡(luò)中的分子數(shù)目，作者限定差異表達(dá)的環(huán)狀RNA必須排在前45位，重復(fù)同樣的分析得到99個(gè)miRNA和224個(gè)差異表達(dá)mRNA（如圖B）。由于精神分裂癥中已有miRNA的研究報(bào)道，作者在網(wǎng)絡(luò)中將這些miRNA及其連接的分子挑選出來組成了新的網(wǎng)絡(luò)（如圖C）。

來點(diǎn)不一樣的——環(huán)狀RNA可變剪切分析

考慮到大腦DLPFC的環(huán)狀RNA表達(dá)的豐富程度，研究人員假設(shè)這些環(huán)狀RNA的形成可能會(huì)伴隨著不同程度的可變剪切存在。在技術(shù)上，CIRCexplorer2程序擴(kuò)展后具有基因組組裝能力，借助Cufflinks以及注釋信息，能夠幫助科研人員鑒定環(huán)狀RNA的可變剪切事件。

利用RNase-enriched的數(shù)據(jù)集，研究人員在全部樣本中發(fā)現(xiàn)約有35%~76%的back-splicing位點(diǎn)存在可變剪切現(xiàn)象，細(xì)分后發(fā)現(xiàn)精分患者組的可變剪切比例稍低于正常對(duì)照（如下圖A）。為了更加精確地度量可變剪切事件，作者分別采用四種計(jì)算方式：Percent Splicesite Usage (PSU) for alternative 5′/3′ splice site selection, Percent Spliced In (PSI) for cassette exon selection and Percent Intron Retention (PIR) for intron retention 對(duì)四種不同的可變剪切事件進(jìn)行度量。如下圖B-E，精神分裂癥患者中環(huán)狀RNA可變剪切水平明顯低于對(duì)照組，且這種趨勢(shì)并不是由于測(cè)序量差異導(dǎo)致的偏差（如下圖F）。

一點(diǎn)總結(jié)

這篇文章在2019年開年憑借幾乎純生物信息分析發(fā)表在老牌雜志《Neuropsychopharmacology 》上自有它的可貴之處。細(xì)讀下來，全文雖然大部分分析內(nèi)容比較常規(guī)，但行文邏輯以及結(jié)果闡述都非常清晰明了。作者在差異分析中不是急于挑選一個(gè)候選分子進(jìn)行下游的生物學(xué)驗(yàn)證，而是將觀察到的病理組的整體表達(dá)下調(diào)這一趨勢(shì)深入研究下去，并且分析了較為復(fù)雜的可變剪切事件。作為精神分裂癥領(lǐng)域第一篇環(huán)狀RNA研究的文章，作者在曝譜的同時(shí)將故事講得如此生動(dòng)還是值得我們學(xué)習(xí)的。