編寫：WB小能手

lncRNA芯片分析的基本步驟

1. 歸一化lncRNA芯片采用的歸一化的方法為quantile normalization。

2. 差異LncRNA的篩選lncRNA芯片中既有l(wèi)ncRNA的探針又有mRNA的探針，分別做差異基因的篩選，篩選方法同表達譜的篩選方法是一致的，參見表達譜的差異基因篩選。

3. 差異lncRNA的重注釋lncRNA芯片注釋不完善，因此需要將篩選出來的lncRNA進行重注釋。將差異lncRNA在基因組上位置上下游延伸，以尋找lncRNA附近的有功能的基因。

4. 差異lncRNA靶基因的預(yù)測lncRNA可能通過調(diào)控相應(yīng)的mRNA發(fā)揮功能，因此有必要預(yù)測lncRNA的靶基因。我們提取差異lncRNA和mRNA的序列，首先用blast進行初篩，之后用RNAplex進行進一步篩選，以預(yù)測lncRNA可能調(diào)控的mRNA。

5. 差異lncRNA與靶基因共表達網(wǎng)絡(luò)預(yù)測出lncRNA的靶基因后，并可進一步在mRNA的數(shù)據(jù)中探尋該mRNA是否發(fā)生表達量的變化。由此構(gòu)建差異lncRNA與靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

6. 差異lncRNA與差異mRNA的共表達分析SBC Human lncRNA芯片能同時檢測出差異表達的lncRNA和mRNA。我們將差異lncRNA和差異mRNA在一組樣品中進行共表達分析，可以發(fā)現(xiàn)與某個lncRNA具有相同表達模式的mRNA。

樣本數(shù)據(jù)要求：每組數(shù)據(jù)3個或3個以上生物學(xué)重復(fù) 實驗組：對照組：

7. 差異lncRNA靶基因的GO analysis對lncRNA的靶基因進行GO Ontology的生物學(xué)的分類，根據(jù)Fisher's Exact Test,得到p-value，得到lncRNA靶基因?qū)?yīng)的顯著性功能，從而了解lncRNA的功能。

8. 差異lncRNA靶基因的pathway analysis對lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫KEGG和Biocarta來進行分類，對Pathway中的基因進行基于離散分布的顯著性分析，得到與實驗?zāi)康挠酗@著聯(lián)系的Pathway 分類,由這些pathway對應(yīng)相應(yīng)的靶基因，從而獲得該分類即導(dǎo)致lncRNA差異的最重要Pathway。

9. 差異lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測提取lncRNA TSS的上游2000bp，下游500bp,利用HMM的算法根據(jù)TRANSFAC8.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測其轉(zhuǎn)錄因子。

10. lncRNA cis作用機制研究：對于感興趣的差異表達lncRNAs，搜索其上下游100K范圍內(nèi)的所有編碼基因，并與該lncRNAs 有顯著共表達的基因取交集。這些在基因組上臨近、且表達模式上共表達的基因很可能被該lncRNAs 所調(diào)控。

11. lncRNA trans作用機制研究：計算LncRNAs 共表達的編碼基因，集合與轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控復(fù)合物的靶基因集合的交集，利用超幾何分布計算該交集的富集程度，得到與lncRNAs 顯著相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而識別可能與lncRNAs 聯(lián)合發(fā)揮調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子/染色質(zhì)調(diào)控因子。

---------介紹---------

長鏈非編碼RNA（lncRNA）

lncRNA長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類不編碼蛋白的RNA 分子，長度在200bp 以上，起初被認為是RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能；近期的研究表明lncRNA 具有保守的二級結(jié)構(gòu)，可以與蛋白、DNA 和RNA 相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控，尤其在腫瘤當中發(fā)揮了重要的調(diào)控角色，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活和抑制、轉(zhuǎn)錄后調(diào)解以及作為miRNA 的誘導(dǎo)分子干擾基因的表達等。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的lncRNA 被注釋，但是絕大多數(shù)的lncRNA 的功能仍然不清楚，因此lncRNA 的研究是一片非常廣闊的未知領(lǐng)域，具有極大的研究價值和意義。

為何細胞不惜耗費能量對這些非編碼RNA的表達和定位進行嚴格調(diào)控呢？這些RNA分析究竟有何功能？RNA測序技術(shù)的發(fā)展使人們得以初窺這一神秘分子，現(xiàn)在lncRNA的許多相關(guān)信息都可以再新數(shù)據(jù)庫中查到，例如Broad研究所、哈佛大學(xué)和麻省理工共同開發(fā)的Human Body Map lincRNAs catalog。雖然近年來關(guān)于lncRNA的研究進展迅猛，但是現(xiàn)在人們了解到的lncRNA只是冰山一角，絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。隨著研究的推進，各類lncRNA的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究作為RNA研究的新領(lǐng)域，已經(jīng)成為一個非常吸引人的方向，有待廣大科學(xué)家去探尋。lncRNA研究當前面臨的一個主要挑戰(zhàn)是，研究工具還在不斷開發(fā)和改進中，而lncRNA研究中非常關(guān)鍵的一步就是發(fā)現(xiàn)與特定疾病相關(guān)的lncRNA。現(xiàn)階段，基因芯片技術(shù)發(fā)展趨于成熟穩(wěn)定，在此平臺上，通過設(shè)計不同檢測lncRNA探針篩選lncRNA是一種準確快捷的方法。lncRNA特征lncRNA通常較長，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，有些具有poly(A)尾巴，有些沒有poly(A)尾巴，分化過程中有動態(tài)的表達與不同的剪接方式，與編碼基因相比，lncRNA表達量更低。

※ 組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達量不同。

※ 時空特異性：同一組織或器官的不同生長階段，其中的lncRNA表達量也會變化。

※ lncRNA啟動子同樣可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，如Oct3/4，Nanog，CREB，Sp1，c-myc，Sox2與p53，局部染色質(zhì)組蛋白同樣具有特征性的修飾方式與結(jié)構(gòu)特征。

※ 大多數(shù)的lncRNA在組織分化發(fā)育過程中，都具有明顯的時空表達特異性，如有人針對小鼠的1300個lncRNA進行研究，發(fā)現(xiàn)在腦組織中的不同部位，lncRNA具有不同的表達模式?！?在腫瘤與其他疾病中有特征性的表達方式。

※ lncRNA的亞細胞位置上也呈多樣化，在細胞核、細胞質(zhì)和細胞器均有分布，甚至某些lncRNA具有獨特的亞細胞位置，有可能是全新的亞細胞構(gòu)成。

lncRNA功能

lncRNA可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控：a) lncRNA通過招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物至特定的基因組位點使其發(fā)生催化活性。如HOTAIR21，Xist、RepA和Kcnqot1招募Polycomb complex至HoxD位點，使得X染色體或Kcnq1功能域的組蛋白H3 第27位賴氨酸發(fā)生3甲基化（me3K27），誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成，從而抑制該區(qū)域基因表達。b) lncRNA通過多種機制進行轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。lncRNA結(jié)合到基因cyclin D1上，招募RNA結(jié)合蛋白TLS來調(diào)控蛋白CBP和p300的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，進而抑制cyclin D1轉(zhuǎn)錄。c) 超保守增強子轉(zhuǎn)錄出lncRNA-Evf2，該lncRNA能激活轉(zhuǎn)錄因子DLX2，進而調(diào)控基因Dlx6轉(zhuǎn)錄。d) DHFR次要啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄出的lncRNA與該基因主要啟動子區(qū)域結(jié)合形成三聚體，抑制轉(zhuǎn)錄因子TFIID結(jié)合，從而使基因DHFR發(fā)生沉默。e) 反義lncRNA能夠與剪接體（splicesome）中鋅指同源mRNA Zeb2的5'剪切位點結(jié)合，使內(nèi)含子未被剪切掉，而該內(nèi)含子序列中保留有內(nèi)部核糖體進入位點（IRE位點），翻譯過程中識別并結(jié)合該位點，導(dǎo)致Zeb2基因表達和翻譯。

lncRNA分子機制隨著lncRNA功能逐步顯現(xiàn)，其與靶點的作用機制成為進一步的熱點。

早期認為原位調(diào)控是LncRNA作用的唯一機制，它通過招募形成染色質(zhì)修飾復(fù)合物而沉默鄰近基因轉(zhuǎn)錄，例如IGF2R反義RNA(antisense of IGF2RRNA，AIR)、XIST等。而Hox基因反義基因間RNA(Hox antisense intergenic RNA，HOTAIR)的發(fā)現(xiàn)提示LncRNA可能存在遠程調(diào)控。同源異型基因(homeotic genes，HOX)在細胞增殖與定向分化中起關(guān)鍵作用，人類Hox基因簇約含100個ncRNA基因，其中HOTAIR定位于HOXC基因座12q13.13。HOTAIR的5'端可招募結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)，借助PRC2上三個H3K27甲基化酶EZH2、SUZ12和EED，使另一基因座HOXD上長約40kb的序列轉(zhuǎn)錄沉默，從而在乳腺上皮細胞內(nèi)使細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄傾向于胚胎成纖維細胞樣表型。超過20%的LncRNA能夠通過結(jié)合PRC2或其他類似復(fù)合物發(fā)揮作用，提示LncRNA的遠程調(diào)控機制在生物體內(nèi)廣泛存在。

其作用機制如上圖所示，主要包括以下幾種情況：

1) 在編碼蛋白基因的上游啟動子區(qū)（橘色）轉(zhuǎn)錄，從而干擾鄰近蛋白編碼基因（藍色）的表達（如酵母SER3基因）；

2) 抑制RNA 聚合酶Ⅱ，或介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白修飾，而影響基因（藍色）表達；

3) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，干擾mRNA的剪切，進而產(chǎn)生不同的剪切形式；

4) lncRNA（紫色）與編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈，在Dicer酶作用下產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA，調(diào)控基因的表達水平；

5) lncRNA（綠色）結(jié)合在特定蛋白質(zhì)上調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白的活性；

6) 作為結(jié)構(gòu)組分與蛋白質(zhì)形成核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體；

7) 結(jié)合在特定蛋白上從而改變該蛋白的胞質(zhì)定位；

8) 可作為小分子RNA（如miRNA）的前體分子。

科研可以是一種快樂

關(guān)注基金申請、聚焦科研熱點、解讀實驗難點