“克隆”顧名思義，即體細(xì)胞無性繁殖，1個(gè)細(xì)胞分裂成2個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行種群繁殖并擴(kuò)大的過程，通過克隆形成率可以反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀，是體外測定細(xì)胞增殖能力的一種常用技術(shù)。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)雖然操作簡單，卻有很多同學(xué)在最終拍照時(shí)很難拿到好看的圖片，不得不一次又一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，今天我們就看看如何規(guī)范的做克隆形成實(shí)驗(yàn)。

克隆形成的目的

1. 評價(jià)不同殺傷因素（藥物、基因等）對腫瘤細(xì)胞增殖能力或群體依賴性的敏感性；

2. 評價(jià)細(xì)胞在體內(nèi)成瘤性，癌細(xì)胞不一定都可以在體內(nèi)成瘤，但若體外克隆能力越強(qiáng)，即表明體內(nèi)成瘤性越強(qiáng)，算是一種模擬體內(nèi)成瘤的體外實(shí)驗(yàn)。

克隆形成實(shí)驗(yàn)步驟

a.接種：取對數(shù)期生長的細(xì)胞以500-1000個(gè)/孔的密度接種于6孔板（接種時(shí)注意梯度稀釋細(xì)胞懸液，觀察細(xì)胞密度，以免因計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)基為含30%FBS的完全培養(yǎng)基；

b.于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-14天左右，每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)，顯微鏡下觀察克隆大?。?/span>3復(fù)孔之間克隆大小應(yīng)相似），待單個(gè)克隆生長到大小不超過圖片視野時(shí)可以進(jìn)行拍照（如下圖左）

c.固定染色：移除培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；移除多聚甲醛，用0.2%結(jié)晶紫染色5min；用水洗滌細(xì)胞，晾干，掃描拍照；（如下圖右）

d.計(jì)數(shù)

注意！注意！注意！高能預(yù)警

細(xì)胞密度為多少合適？

細(xì)胞接種密度與最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果密切相關(guān)，若細(xì)胞太多，形成克隆數(shù)目太多，很難拍到單獨(dú)的克隆團(tuán)。而細(xì)胞太少，可能無法形成克隆，從而影響對該細(xì)胞增殖能力的判斷。一般來說，正常增殖速度為1:5-1:10傳代，3天長滿細(xì)胞，可以接種500個(gè)細(xì)胞，其余增殖緩慢細(xì)胞，可以接種800-1000。

細(xì)胞接種后培養(yǎng)的時(shí)間，如何確定？

通常情況下，單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上所組成的細(xì)胞群稱為一個(gè)陽性克隆，時(shí)間約為一周；但具體時(shí)間因細(xì)胞增殖能力而已異，因此應(yīng)密切關(guān)注細(xì)胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個(gè)克隆細(xì)胞數(shù)到達(dá)50個(gè)左右即可固定細(xì)胞。

細(xì)胞鋪板均勻的重要性

若鋪板不均勻，細(xì)胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并且拍出的圖片不美觀。

細(xì)胞未形成克隆的原因？

并非每種細(xì)胞都可以形成克隆，克隆形成率與細(xì)胞本身增殖能力有關(guān)。還與接種細(xì)胞密度，加入培養(yǎng)液的體積、血清濃度有關(guān)。因該實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間較長，應(yīng)給細(xì)胞多加培養(yǎng)基，如每孔4ml，或者3天更換一次培養(yǎng)基，以供給細(xì)胞充足的營養(yǎng)。

以上為本次為大家介紹的細(xì)胞克隆形成的實(shí)驗(yàn)方法，它們的操作過程很簡單，但是我們會(huì)遇到很多小問題，導(dǎo)致最終結(jié)果不理想，切記，控制接種密度，鋪板均勻是2大關(guān)鍵點(diǎn)，多多練習(xí)摸索，一定會(huì)有好數(shù)據(jù)和圖片哦！