隨著生物制藥行業(yè)的飛速發(fā)展，藥企將會布局越來越多的項(xiàng)目管線以及開發(fā)多樣化的藥物分子。近些年，藥品審評審批制度的改進(jìn)，使得大批生物藥進(jìn)入臨床的步伐大大加快，從而惠及更多的患者。2018年12月君實(shí)拓益以其K/O藥20-50%的價格，轟動業(yè)內(nèi)，預(yù)計(jì)一年可以為患者節(jié)約十幾萬元。然而，對于生物制藥企業(yè)而言，機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存，生物類似藥的競爭將會愈演愈烈，一方面，如何有效降低成本，造福更多的患者；另一方面，如何提高產(chǎn)品質(zhì)量，贏得更多的市場份額，已成為生物藥企的生存法則。

為了有效地降低生產(chǎn)成本，提高廠房利用率，需要新技術(shù)的變革。越來越多的生物制藥巨頭已轉(zhuǎn)向連續(xù)生物生產(chǎn)工藝。2016年4月，美國強(qiáng)生公司位于波多黎各的藥品生產(chǎn)基地的連續(xù)制造生產(chǎn)車間工藝轉(zhuǎn)換獲得FDA批準(zhǔn)，這是FDA第一次批準(zhǔn)批制造向連續(xù)制造的生產(chǎn)工藝變更，目前有三個抗體品種已部分使用連續(xù)制造工藝。禮來制藥將愛爾蘭作為全球連續(xù)制造中心；葛蘭素史克在新加坡建立連續(xù)制造工廠，并于2016年投入使用；安進(jìn)在新加坡建立單克隆抗體的連續(xù)純化制造車間；最近，BiosanaPharma宣布其開發(fā)的奧馬珠單抗生物類似要獲批進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，是目前第一個使用全連續(xù)生產(chǎn)工藝開發(fā)的單克隆抗體藥物。

與此同時，包括FDA,EMA, PMDA在內(nèi)的法規(guī)監(jiān)管部門開始更多關(guān)注連續(xù)制造工藝并鼓勵制藥企業(yè)用更有效的制藥工藝來生產(chǎn)更安全、更穩(wěn)定、更經(jīng)濟(jì)的藥物。早在2017年，F(xiàn)DA就發(fā)布了連續(xù)制造（Continuous manufacturing）的意見征求稿;2019年2月26日，F(xiàn)DA頒布了連續(xù)制造的指南草案，對于連續(xù)制造的法規(guī)指導(dǎo)做了進(jìn)一步說明。

生物制藥目前都是以Batch生產(chǎn)（批生產(chǎn)）方式，即從工藝起點(diǎn)開始，經(jīng)過多個有停頓的中間步驟，最終獲得終產(chǎn)品的過程。連續(xù)生產(chǎn)工藝即連續(xù)生產(chǎn)，在食品， 石化和化學(xué)品生產(chǎn)上已經(jīng)被使用多年，和Batch不同的是，連續(xù)生產(chǎn)中原料在工藝起點(diǎn)持續(xù)加入，終產(chǎn)品在終點(diǎn)持續(xù)收獲，理論上中間沒有停留的步驟，所以被稱之為連續(xù)生產(chǎn)。在這一過程中，藥品的質(zhì)量在生產(chǎn)過程中可以被很好的控制，而不是只依靠終產(chǎn)品達(dá)標(biāo)來放行。

1. 降低工藝風(fēng)險，提高藥品質(zhì)量

由于批生產(chǎn)過程中會有不同工藝步驟的停止和啟動，在每一步中都會帶來一定程度的復(fù)雜性和不確定性。而連續(xù)生產(chǎn)工藝有助于產(chǎn)品的始終如一。與此同時，連續(xù)生產(chǎn)工藝適用QbD的工藝設(shè)計(jì)原則，從而提高工藝靈活性。

2. 減少獨(dú)立操作單元的周轉(zhuǎn)及多批次間隔時間

連續(xù)生產(chǎn)工藝通過模塊化的操作集成，減少不同獨(dú)立工藝單元的暫停和停止時間，產(chǎn)品質(zhì)控放行時間，以及更小的設(shè)備和占地空間需求，從而降低生產(chǎn)成本, 有報道連續(xù)生產(chǎn)工藝可以降低75%的生產(chǎn)成本。

3. 減少廠房空間及廠房建設(shè)時間

連續(xù)生物工藝不需要很大的硬件配置即可滿足產(chǎn)能需求。相比目前平均5年時間的廠房建設(shè)時間，未來的廠房建設(shè)時間僅需要18個月，大大縮短了產(chǎn)品上市時間，從而提升企業(yè)競爭力。

上游工藝

連續(xù)灌流培養(yǎng)

灌流培養(yǎng)技術(shù)通過向反應(yīng)器內(nèi)連續(xù)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，同時取出耗竭的培養(yǎng)基，可維持更長的細(xì)胞培養(yǎng)時間，可高達(dá)數(shù)月。相比目前主流的批次流加培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)技術(shù)通過延長培養(yǎng)時間，獲得更高的細(xì)胞密度，增加目的產(chǎn)物表達(dá)量，與此同時，目的產(chǎn)物在生物反應(yīng)器中更短的滯留時間，使得產(chǎn)物維持更好的質(zhì)量。灌流培養(yǎng)技術(shù)使用的生物反應(yīng)器的體積更小，節(jié)約硬件成本的同時，可在較小的生產(chǎn)空間內(nèi)實(shí)現(xiàn)同等或更高的產(chǎn)量。

除了灌流培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，用于灌流培養(yǎng)的培養(yǎng)基也備受關(guān)注。如何高效利用培養(yǎng)基，在很大程度上降低成本。這是由于相比批次流加培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)工藝中培養(yǎng)基的消耗量至少三倍以上。通常通過高密度少培養(yǎng)基同時減少灌流體積的培養(yǎng)方式來提高灌流培養(yǎng)工藝的經(jīng)濟(jì)性，然而普通的培養(yǎng)基很難能夠維持這樣的細(xì)胞生長穩(wěn)態(tài)。適用于灌流培養(yǎng)工藝的培養(yǎng)基不僅需要養(yǎng)料充分，而且要最大程度減少毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生。EX-CELL? HD灌流培養(yǎng)基，可有效提高產(chǎn)能并使細(xì)胞灌流率從80 pL/c/d降低至40甚至20 pL/c/d （圖1）。

圖1. EXCELL? HD 灌流培養(yǎng)基prototype細(xì)胞灌流率數(shù)據(jù)比較

下游工藝

高密度細(xì)胞培養(yǎng)液澄清

為了有效提高灌流培養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)性，在減少培養(yǎng)基用量的同時，需要高細(xì)胞密度培養(yǎng)以達(dá)到預(yù)期的滴度，然而，高細(xì)胞密度培養(yǎng)液由于細(xì)胞碎片及釋放的HCP和DNA大大增加，從而對于傳統(tǒng)的下游澄清和純化帶來了越來越大的負(fù)擔(dān)。如何有效地提高高密度細(xì)胞培養(yǎng)液澄清步驟載量，去除HCP和DNA雜質(zhì)，將在很大程度上降低企業(yè)的生產(chǎn)成本。Millistak ?HC Pro由于其全人工合成材質(zhì)的特點(diǎn)，更加純凈，沖洗體積可有效減少50%，獨(dú)特的材質(zhì)，使得載量大幅提升的同時擁有較好的HCP 和DNA去除效果(圖2)。

圖2. Millistak ? HC Pro （D0SP/X0SP）載量與雜質(zhì)去除能力對比

對于更高密度的細(xì)胞培養(yǎng)，如大于15x10^6 c/mL的培養(yǎng)液澄清，則特別適合采用絮凝技術(shù)。絮凝技術(shù)是通過降低料液的pH值，或者添加離子型的絮凝劑，通過靜電作用吸附細(xì)胞碎片，HCP以及DNA聚集為更大的顆粒分子，進(jìn)一步通過具有密度梯度結(jié)構(gòu)的Clarisolve?深層過濾器實(shí)現(xiàn)一步澄清。聚合物改性的聚烯丙胺（mPAA）和聚二烯丙基二甲基氯化銨(pDADMAC ) ，是非常有效的絮凝劑，配合Clarisolve?深層過濾器結(jié)合使用時，對于高細(xì)胞密度料液的澄清有很好的效果（圖3）。目前，已有上市藥物采用絮凝技術(shù)提高工藝效率與經(jīng)濟(jì)性。

圖3. 采用mPAA進(jìn)行絮凝處理前后的澄清過濾載量對比

流穿精純平臺

關(guān)于下游工藝的整合，目前有很多的策略。例如，通過串聯(lián)親和層析和陰離子交換層析，實(shí)現(xiàn)半連續(xù)的工藝連接；應(yīng)用多柱位連續(xù)層析系統(tǒng)，通過有效提高層析填料的載量和工藝流速，來提高生產(chǎn)效率?；蚴菍刹搅鞔┚児に囘M(jìn)行整合，如陰離子和陽離子層析步驟，僅通過泵就可以實(shí)現(xiàn)兩步精純工藝。有研究指出，相比傳統(tǒng)的精純層析工藝，通過流穿精純平臺，可以簡化層析工藝，縮短工藝時間，減少填料使用量，由于不需要使用tank而減少硬件設(shè)備的投入，從而有效提高產(chǎn)能，降低工藝成本。若要實(shí)現(xiàn)陰陽離子層析的流穿精純工藝，采用傳統(tǒng)的吸附模式陽離子層析不易實(shí)現(xiàn)。而采用新型的Eshmuno? CP?FT陽離子層析填料，通過流穿模式實(shí)現(xiàn)多聚體的去除，相比傳統(tǒng)的結(jié)合洗脫模式，載量提升10倍。CP?FT的神奇之處在于其獨(dú)特的觸手型化學(xué)修飾，通關(guān)前沿層析的原理，實(shí)現(xiàn)聚集體置換單體從而有效去除聚集體的目的（圖4）。以1 kg抗體純化為例，采用傳統(tǒng)的吸附/洗脫模式的陽離子層析，按照80 g/L的載量，需要使用12.5 L 的填料以及313 L 的緩沖液；而采用CP-FT，載量為1000g/L, 僅需要1 L的填料和15 L的緩沖液(圖5)，通過減少緩沖液和填料使用量，來有效降低成本。采用流穿精純平臺，載量顯著提高的情況下，仍然有很好的雜質(zhì)去除效果（表1）。

圖4.CP-FT的單體收率及多聚體去除

圖5.傳統(tǒng)吸附/洗脫陽離子及CP-FT用量對比

表1. 傳統(tǒng)吸附/洗脫陽離子及CP-FT純化效果對比

膜層析

目前，連續(xù)多步層析已應(yīng)用于連續(xù)生物工藝的純化操作單元。與此同時，新的層析技術(shù)也在不斷地發(fā)展，例如一次性膜層析技術(shù)，可以大大提高產(chǎn)能及雜質(zhì)去除。由于一次性使用的特點(diǎn)，省去了驗(yàn)證，清潔，存儲的相關(guān)工藝時間，節(jié)約人力和工藝時間成本。Natrix?膜層析技術(shù)，采用獨(dú)特的3D大孔結(jié)構(gòu)，大大提升了膜孔內(nèi)的表面積，從而結(jié)合高密度的官能團(tuán)有效提升載量；連通的孔隙結(jié)構(gòu)，有效提高通量(圖6)。以生產(chǎn)1000g抗體為例，采用傳統(tǒng)的層析工藝，除層析柱外，需要6.3 L 層析填料，且工藝時間需要6小時。而采用Natrix? HD-Q,采用0.115 L MV在2小時內(nèi)即可完成生產(chǎn)(圖7)。

圖6. Natrix?結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)層析填料及膜層析結(jié)構(gòu)對比

圖7. 膜層析工藝的經(jīng)濟(jì)性分析

在線病毒滅活

從傳統(tǒng)的批次低pH滅活工藝轉(zhuǎn)向在線持續(xù)的病毒滅活工藝，通過連接的管道式滅活箱來取代傳統(tǒng)的tank（圖8）。在線病毒滅活，將有效減少占地空間，不再需要多個tank存儲protein A親和層析洗脫液，與此同時，在管道滅活腔中的停留時間會比傳統(tǒng)tank中孵育時間更短，使目標(biāo)物質(zhì)在酸性條件下孵育更短的時間，從而減少目標(biāo)蛋白的降解，提高產(chǎn)品質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，采用在線病毒滅活的效果同傳統(tǒng)的批次低pH滅活工藝（圖9）。

圖8. 管道式滅活箱

圖9. 不同pH條件下在線病毒滅活與傳統(tǒng)病毒滅活效果比較

單向切向流 （SPTFF）

單向切向流在其他行業(yè)應(yīng)用廣泛，但在生物制藥行業(yè)中剛剛興起。通過單向切向流技術(shù)對樣品進(jìn)行濃縮，不需要對樣品回流進(jìn)行循環(huán)，減少對樣品剪切力損傷的同時，不需要使用tank,從而減少設(shè)備占地空間。Genetech曾通過單向切向流技術(shù)解決了目前廠房無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。另一方面，通過單向切向流進(jìn)行樣品在線濃縮，減少下一步純化工藝的上樣體積，有效節(jié)約上樣時間，工藝時間大大縮短，從而使得產(chǎn)能提高5倍。與此同時，根據(jù)吸附層析的平衡等溫線性質(zhì)，高濃度的雜質(zhì)會更容易吸附在層析填料上，從而使流穿陽離子的載量更高。單向切向流還特別適合于洗脫后樣品的脫鹽和濃縮處理，省去換液及樣品稀釋的工藝步驟，有效提高工藝效率。研究發(fā)現(xiàn)，采用2000 L批次培養(yǎng)與200 L灌流培養(yǎng)，整合SPTFF與Eshmuno?  Q的工藝成本，相比傳統(tǒng)的純化工藝成本而言，可降低30-40%（圖10）。

圖10 整合SPTFF的連續(xù)工藝與傳統(tǒng)工藝的經(jīng)濟(jì)性分析

A. 2000 L批次生物反應(yīng)器 B. 200 L灌流培養(yǎng)生物反應(yīng)器

連續(xù)的生物工藝由于其各個工藝步驟都是連續(xù)的，對于工藝中的在線監(jiān)測和在線質(zhì)量控制是一大挑戰(zhàn)。與此同時，連續(xù)工藝的復(fù)雜性，如何使用QbD來開發(fā)連續(xù)工藝，連續(xù)工藝的工藝轉(zhuǎn)移及放大，以及整個連續(xù)工藝中的污染風(fēng)險控制，都是需要繼續(xù)深入探討的話題。

新技術(shù)發(fā)展為平臺技術(shù)往往需要時間的驗(yàn)證和更新，連續(xù)生物工藝由于其顯著降低成本的優(yōu)勢而備受關(guān)注，近兩三年會更多側(cè)重鄰近工藝的整合，預(yù)計(jì)在2025年會實(shí)現(xiàn)全面的生物連續(xù)工藝。在新技術(shù)不斷涌現(xiàn)的時代，諸如灌流培養(yǎng)基，高密度細(xì)胞澄清方案，流穿式陽離子層析，在線病毒滅活以及單向切向流的應(yīng)用，將大大提升產(chǎn)能并有效降低生產(chǎn)成本。

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16. 基于創(chuàng)新全連續(xù)工藝開發(fā)的單抗類似藥獲批進(jìn)入臨床，生物藥之家

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默克工藝解決方案是默克生命科學(xué)三大事業(yè)部之一，致力于為生物制藥、化學(xué)制藥企業(yè)提供產(chǎn)品開發(fā)、商業(yè)化生產(chǎn)所需全系列工具，已成為預(yù)過濾、無菌過濾、除病毒過濾、超濾、層析純化、一次性生產(chǎn)、培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、緩沖液、藥用原輔料、工程技術(shù)及驗(yàn)證領(lǐng)域的全球領(lǐng)導(dǎo)者。默克工藝解決方案的成功源于對高質(zhì)量產(chǎn)品、先進(jìn)監(jiān)管技術(shù)的不懈追求以及致力于幫助客戶實(shí)現(xiàn)其需求的精神。