1范 圍

2規(guī)范性引用文件

3術(shù)語(yǔ)和定義

4原  理

所用的試劑，除特別注明者外均為分析純?cè)噭?strong>水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；試劑和材料包括：

a)正已烷。

b)乙酸乙酯。

c)乙腈：HPLC級(jí)。

d)甲酸：優(yōu)級(jí)純。

e)乙酸銨：色譜純。

f)冰乙酸：優(yōu)級(jí)純。

g)20mmol/L乙酸溶液：取乙酸銨1.54g1000mL量瓶中，加水適量，加入甲酸2.0mL加水至刻度，搖勻。

h)1mol/L氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉4.0g，加水100mL溶解。

i)1mol/L鹽酸溶液：取濃鹽酸20.8mL，加水稀釋至250mL。

j) △⁹ 四氫大麻酸對(duì)照品溶液：市售100g/m甲溶液，置冰箱中冷凍保存。保存時(shí)間為12個(gè)月。              

k) △⁹ 四氫大麻酸對(duì)照品工作溶液：試驗(yàn)中所用其他濃度的對(duì)照品溶液均從上述對(duì)照品溶液用甲醇稀釋得到，密封，置于冰箱中冷藏保存，保存時(shí)間為3個(gè)月。

l)內(nèi)標(biāo)物△⁹ 四氫大麻酸-d₉對(duì)照品溶液；市售00g/mL甲溶液，冰箱中冷凍保存。保存時(shí)間為12個(gè)月。

m)內(nèi)標(biāo)物△⁹ 四氫大麻酸-d。對(duì)照品工作溶液；內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液用甲醇稀釋，配制成10pg/mL的工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存。保存時(shí)間為3個(gè)月。

n)具塞玻璃試管。

o)精密pH試紙。

儀器設(shè)備包括：

a)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)。

b)渦旋振蕩器。

c)離心機(jī)。

d)恒溫水浴鍋。

e)精密移液器：10μL ~100μL、100μL ~1000μL 。

f)電子天平。

7.1 定性分析

7.1.1 樣品提取

精密量取待測(cè)樣品尿液1mL，加入1mL的1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至pH13，80℃水浴中水解30min，冷卻后加入1mL的1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH7~8，再加入100μL冰乙酸，調(diào)至pH4~5，加入3mL正已烷：乙酸乙酯(9：1)，混旋，離心吸取上清液，60℃水浴空氣流下吹干，殘留物中加入200μL乙腈：20mmol/L乙酸銨溶液(9：1)定容，取5μL供LC-MS/MS檢測(cè)。

7.1.2 添加樣品及空白樣品

取空白尿液樣品1mL兩份，一份添加△⁹ 四氫大麻酸工作溶液制得15ng/mL添加樣品，一份做陰性對(duì)照，按上述操作與待測(cè)樣品平行提取和分析。

7.1.3 儀器檢測(cè)

7.1.3.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀參考條件

以下為參考條件，按照本法所獲得的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖參見(jiàn)附錄A中的圖A.1，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：

a)色譜柱：MG II C18，3μm，50mm×3mm(內(nèi)徑)或相當(dāng)者；

b)柱溫：室溫；

c)流動(dòng)相：乙腈：20mmol/L乙酸胺和0.1%甲酸緩沖液(9：1)；

d)流速：200μL/min；

e)進(jìn)樣量：5μL；

f)離子源：ESI，負(fù)離子模式；

g)離子噴霧電壓：4000V；

h)離子源溫度：450℃；

i)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；

j)碰撞氣、氣簾氣等氣流值應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；

k) △⁹ 四氫大麻酸和內(nèi)標(biāo)物的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量見(jiàn)表1。

7.1.3.2 進(jìn)樣

分別吸取待測(cè)樣品、空白和添加樣品提取液，按7.1.3.1條件進(jìn)樣分析。

7.1.3.3 記錄和計(jì)算

記錄各得測(cè)樣品及添加樣品平行進(jìn)樣后△⁹ 四氫大麻酸的保留時(shí)間及峰面積值。

在相同的試驗(yàn)條件下，待測(cè)樣品中出現(xiàn)兩對(duì)定性離子對(duì)色譜峰，其保留時(shí)間與添加樣品中△⁹ 四大麻酸保留時(shí)間比較，相對(duì)誤差在士2.5%內(nèi)，且相對(duì)離子對(duì)豐度比與質(zhì)量濃度相近添加樣品中的相對(duì)離子對(duì)豐度比之相對(duì)誤差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在△⁹ 四氫大麻酸。

7.2 定量分析

7.2.1 樣品提取

取待測(cè)樣品1mL兩份，加入10μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，余下同7.1.1。

另取空白樣品兩份，根據(jù)待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度情況添加系列質(zhì)量濃度的△⁹ 四氧大麻酸，作為添加樣品，與待測(cè)樣品平行操作待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度應(yīng)在工作曲線的線性范圍內(nèi)。

7.2.2 儀器檢測(cè)

儀器參考條件同7.1.3.1。

7.2.3 進(jìn)樣

分別取待測(cè)樣品、系列質(zhì)量濃度的添加樣品，按7.1，3.1條件進(jìn)樣分析。

7.2.4 記錄與計(jì)算

在系列濃度的△⁹ 四氫大麻酸添加樣品中以△⁹ 四氫大麻酸與內(nèi)標(biāo)物定量離子對(duì)的峰面積比(Y) 為縱坐標(biāo)、△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程。

根據(jù)待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸及內(nèi)標(biāo)物定量離子對(duì)的峰面積值，按式(1)計(jì)算出待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸的質(zhì)量濃度?！?sup>9 四氫大麻酸的線性準(zhǔn)確度和精密度的試驗(yàn)數(shù)據(jù)參見(jiàn)附錄B中的表B.1和表B.2。

7.2.5 平行試驗(yàn)

待樣品同時(shí)平行測(cè)定兩份，雙樣相對(duì)相差按式(2)計(jì)算：

8.1 定性結(jié)果評(píng)價(jià)

8.1.1 陰性結(jié)果評(píng)價(jià)

若添加樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，待測(cè)樣品中未檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，則陰性結(jié)果可靠若添加樣品中未檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，則陰性結(jié)果不可靠。

8.1.2 陽(yáng)性結(jié)果評(píng)價(jià)

若待測(cè)樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，且空白樣品無(wú)干擾，則陽(yáng)性結(jié)果可靠；若待測(cè)樣品中檢出△⁹ 四氫大麻酸成分，且空白樣品亦呈陽(yáng)性，則陽(yáng)性結(jié)果不可靠。

8.2 定量結(jié)果評(píng)價(jià)

若待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度的雙樣相對(duì)相差小于或等于20%，定量數(shù)據(jù)可靠，其質(zhì)量濃度按兩份樣品的平均值計(jì)算。若待測(cè)樣品中△⁹ 四氫大麻酸質(zhì)量濃度的雙樣相對(duì)相差大于20%，定量數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)按7.2重新提取檢驗(yàn)。

8.3 檢出限和定量下限

本標(biāo)準(zhǔn)尿液中△⁹ 四氫大麻酸的檢出限為4ng/mL，定量下限為10ng/mL。

（資料性附錄） △⁹ 四氫大麻酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖  見(jiàn)圖A.1

（資料性附錄） 線性、精密度和準(zhǔn)確度