概述

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝膠電泳中最常用的一種蛋白表達(dá)分析技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)的原理，是根據(jù)檢體中蛋白質(zhì)分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。在大腸桿菌表達(dá)純化外源蛋白的實(shí)驗(yàn)中，SDS-PAGE更是必不可少的操作，其通常用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況（表達(dá)量，表達(dá)分布），以及分析目的蛋白的純度等。

SDS-PAGE作用機(jī)理

蛋白中含有很多的氨基( )和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現(xiàn)出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關(guān)，我們?cè)谏蠘忧?，通常?huì)進(jìn)行一些處理(上樣

緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS 和β-巰基乙醇的上緩沖液。SDS 即十二烷基磺酸鈉

（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na ），是一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)； β-巰基乙醇是強(qiáng)還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后，經(jīng)過高溫處理，其目的是將SDS 與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)完全變性和解聚，并形成棒狀結(jié)構(gòu)同時(shí)使整個(gè)蛋白帶上負(fù)電荷；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，用于監(jiān)控整個(gè)電泳過程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當(dāng)樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負(fù)極，下方為正極)，在凝膠中形成移動(dòng)界面并帶動(dòng)凝膠中所含SDS負(fù)電荷的多肽復(fù)合物向正極推進(jìn)。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS 多肽復(fù)合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區(qū)帶（或稱積層）。

電泳啟動(dòng)時(shí)，蛋白樣品處于pH6.8 的上層，pH8.8 的分離膠層在下層，上槽為負(fù)極，下槽為正極。出現(xiàn)了 pH 不連續(xù)和膠孔徑大小不連續(xù)：?jiǎn)?dòng)時(shí)Clˉ解離度大，Proˉ解離度居中，甘 aaCOOˉ解離度小，遷移順序?yàn)椋╬H6.8）Clˉ> Proˉ >—COOˉ。在 Clˉ與 Proˉ之間和 Proˉ與—COOˉ之間都將出現(xiàn)低離子區(qū)，同時(shí)也出現(xiàn)高電勢(shì)，高電勢(shì)迫使 Proˉ向 Clˉ遷移，—COOˉ向 Proˉ遷移。如：一個(gè) Clˉ領(lǐng)路，—COOˉ推動(dòng)，蛋白在中間，這樣就起到濃縮的作用了。在濃縮膠運(yùn)動(dòng)中，由于膠聯(lián)度小，孔徑大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上成層，起濃縮效應(yīng)，使全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，此時(shí)Proˉ，Clˉ，甘 aa 離子在 pH8.8 的溶液中，Clˉ完全電離而很快到達(dá)正極，甘 aa 電離度加大很快躍過蛋白質(zhì)，而到達(dá)正極，只有蛋白質(zhì)分子在分離膠中較為緩慢的移動(dòng)。由于 Proˉ在電泳過程中，受到溶液離子的變化而 pH 值發(fā)生變化，但每一瞬間，其所帶電荷數(shù)除以單位質(zhì)量是不同的，所以帶負(fù)電荷多者遷移快，反之則慢，這就現(xiàn)了電荷效應(yīng)。由于膠孔徑小，而且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對(duì)大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應(yīng)，也就是蛋白質(zhì)在分離膠中，以分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)而出現(xiàn)遷移率的差異，最終達(dá)到彼此分開。

PAGE 膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合，形成膠，如下圖：

注：催化劑：過硫酸銨（AP）在隔氧的狀態(tài)下，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用新鮮的。

加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網(wǎng)狀聚合物。

SDS聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍：

試劑及主要器材

通常在SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)中用到以下幾種試劑：

1、主要試劑

•  30％凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加雙蒸水至100mL。外包錫紙，4℃冰箱保存，30天內(nèi)使用。

• 分離膠緩沖液(1.5mol／L): Tris 18.17g，加雙蒸水溶解，6mol/L HCl調(diào)pH8.8，定容100mL。4℃冰箱保存

• 濃縮膠緩沖液(0.5mol／L): Tris 6.06g，加水溶解，6mol/L HCl調(diào)8，并定容到100mL。4℃冰箱保存

• 電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加雙蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。

• 10％SDS，室溫保存

• 質(zhì)量濃度10％過硫酸銨(新鮮配制)

• 上樣緩沖液：5mol／L Tris-HCl pH6.8  1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巰基乙醇1mL，0.1％溴酚藍(lán)0.5mL，加蒸餾水定溶至10mL。

• 考馬斯亮藍(lán)R-250染色液（1L）：1g考馬斯亮藍(lán)R250，加入450甲醇，100ml冰醋酸

• 脫色液（1L）：100ml甲醇，100ml冰醋酸

• 未知分子量的蛋白質(zhì)樣品(1mg／mL )

2、實(shí)驗(yàn)器材

• 垂直板電泳槽

• 電泳儀

• 長(zhǎng)滴管及微量加樣器

• 燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培養(yǎng)皿(15cm′l5cm)

• 槍頭（1ml、200ul、10ul）

• 注射器等

SDS-PAGE所需溶液：

A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀酰胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾于棕色玻璃瓶中4℃貯存。

B液——1.5mol/L  Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs堿，溶于60mL（30mL）去離子水中，加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。

C液——1.5mol/L  Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs堿，溶于60mL（30mL）去離子水中，加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。

D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去離子水中，定容至100mL(20mL)，加熱至68℃助溶。

E液——10％過硫酸銨：5g(0.5g)過硫酸銨，溶于50mL(5mL)去離子水中；現(xiàn)配現(xiàn)用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，低溫保存。

聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)。

制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇TRIS-HCL系統(tǒng)。

TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應(yīng)進(jìn)行。

十二烷基硫酸鈉（SDS）：陰離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。

注意：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無(wú)毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。

SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作流程

1. 清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點(diǎn)洗衣粉  輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來(lái)水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

2. 灌膠與上樣

• 玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。）

• 配 12％分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用 3ml的吸管或10ml 槍吸取適量的膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時(shí)開始可快一些，膠面快到所需高度時(shí)要放慢速度。操作時(shí)膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(huì)有氣泡。加水液封時(shí)要很慢，否則膠會(huì)被沖變型。）

分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置12％的分離膠和5.1％的濃縮膠。

注：分離膠與濃縮膠的濃度計(jì)算公式：

A%*Va/V總 =C ，A%為30％凝膠貯備液，

例如，12%的分離膠：0.3*10/25=12%

• 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說(shuō)明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。

• 按前面方法配 5.1％的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時(shí)也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時(shí)要使梳子保持水平。由于膠凝固時(shí)體積會(huì)收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。

• 用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）

• 測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含 50μg 蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至 0.5ml 離心管中，加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過 15μl，加樣孔的最大限度可加 20μl 樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮 5min 使蛋白變性。

• 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測(cè)的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3 次，以免交叉污染。

3. 電泳

加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關(guān)后，樣品進(jìn)膠前電壓控制在100～200V，大約15～20min；樣品中的溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)分離膠之后，電壓升到200V，電泳過程保持電壓穩(wěn)定。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑遷移到距前沿1～2cm處即停止電泳，約0.5-1小時(shí)。如室溫高，打開電泳槽循環(huán)水，降低電泳溫度。

電泳。

4. 染色、脫色

電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，在長(zhǎng)短兩塊玻璃板下角空隙內(nèi)，用刀輕 輕撬動(dòng)，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區(qū)帶中心插入銅絲作為標(biāo)志，放入大培養(yǎng)皿中染色，使用0.25％的考馬斯亮藍(lán)染液，染色2～4h，必要時(shí)可過夜。

棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進(jìn)行擴(kuò)散脫色，經(jīng)常換脫色液，直至蛋白質(zhì)帶清晰為止。

5. 結(jié)果處理

• 測(cè)量脫色后凝膠板的長(zhǎng)度和每個(gè)蛋白質(zhì)樣品移動(dòng)距離(即蛋白質(zhì)帶中心到加樣孔的距離)，測(cè)量指示染料遷移的距離。

• 按以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率(Rm)

相對(duì)遷移率＝樣品遷移距離(cm)／染料遷移距離(cm)

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上做圖，得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

• 測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的分子量：根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得該蛋白質(zhì)的分子量。

SDS-PAGE電泳實(shí)例圖

注意事項(xiàng)

• APS和TEMED是促凝的，根據(jù)溫度加入的量是可以變動(dòng)，一般不超過30％。

•  玻璃板一定要洗干凈，否則制膠是會(huì)有氣泡。

• 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時(shí)注意安全，戴手套。（凝膠以后，聚丙烯酰胺毒性降低。）

• 凝膠的時(shí)間要嚴(yán)格控制好，一般在20-30min。

•  點(diǎn)樣時(shí)，如果孔比較多，盡量點(diǎn)在中央。（點(diǎn)在邊上時(shí)，跑出的帶是斜的）

• 點(diǎn)樣前要排盡膠底部的氣泡，防止干擾電泳。

• 電泳結(jié)束后，取膠時(shí)，小心把玻璃板翹起（防止再次落下）。

• 脫色時(shí)，盡量多次進(jìn)行換水。

• 上樣量不宜太高，蛋白含量每個(gè)孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl。

• 做膠時(shí)，凝膠時(shí)間控制在25min。梳子需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。

• 上樣時(shí)，Marker最好標(biāo)在中間，邊上的孔盡量不要上樣。

• 制膠時(shí)，在加APS前盡量不要攪拌，加入APS后可以輕輕攪拌，不要產(chǎn)生氣泡。

• 分離膠緩沖液的pH一定要準(zhǔn)確，盡量在20℃左右調(diào)掉8.8

• 安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。

• 凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無(wú)法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。

• 微量注射器（加樣器）上樣時(shí), 注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品下沉?xí)r易發(fā)生擴(kuò)散，溢出加樣孔。

• 剝膠時(shí)要小心,保持膠完好無(wú)損,染色要充分。

注意：溫度，時(shí)間，光照，APS和TEMED都會(huì)對(duì)凝膠產(chǎn)生影響

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