吳家睿 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所 研究員

導(dǎo)讀

腫瘤患者廣泛存在著個(gè)體之間的差異以及個(gè)體的腫瘤組織內(nèi)部差異，需要通過生物標(biāo)志物來(lái)區(qū)分和確定對(duì)藥物具有不同響應(yīng)的個(gè)體。因此，生物標(biāo)志物在抗腫瘤藥物研發(fā)中起著重要的作用。

抗腫瘤藥物研發(fā)是當(dāng)前創(chuàng)新藥物研發(fā)最活躍的領(lǐng)域，也是生物標(biāo)志物最能夠體現(xiàn)'英雄用武'之領(lǐng)域。腫瘤患者不僅廣泛存在著個(gè)體異質(zhì)性（Inter-tumour heterogeneity），而且在每個(gè)個(gè)體的腫瘤組織中也普遍存在內(nèi)部差異（Intra-tumour heterogeneity），因此需要通過生物標(biāo)志物來(lái)區(qū)分和確定對(duì)藥物具有不同響應(yīng)的個(gè)體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，如果在腫瘤臨床試驗(yàn)中納入正確的生物標(biāo)志物，可將藥物最終獲批的可能性提高10％到25％。

美國(guó)食品與藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）在2018年度批準(zhǔn)了多個(gè)基于伴隨診斷的腫瘤分子靶向藥物，例如用于治療攜帶ALK基因重組的非小細(xì)胞肺癌的藥物“Lorlatinib”。隨后FDA進(jìn)一步推出了一個(gè)伴隨診斷分類標(biāo)簽指南草案，主要針對(duì)個(gè)體化抗腫瘤藥物伴隨診斷的分類標(biāo)簽，即在特定情況下，如果試驗(yàn)證據(jù)足以證明某一伴隨診斷產(chǎn)品適用于一組或一類治療藥物，則該診斷產(chǎn)品的預(yù)期用途或適應(yīng)證將涵蓋這些藥物，而不限于單個(gè)藥物。這些情況表明，FDA已經(jīng)把生物標(biāo)志物視為抗腫瘤藥物研發(fā)和應(yīng)用的主要基礎(chǔ)。

 最主要的腫瘤生物標(biāo)志物：基因變異

腫瘤的形成和發(fā)展源于大量的基因變異，每一種腫瘤往往都具有成百上千的基因變異。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞基因組的DNA序列變異被公認(rèn)是抗擊腫瘤的關(guān)鍵。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院在2006年啟動(dòng)了一項(xiàng)名為“癌癥基因組圖集”（The Cancer Genome Atlas，TCGA）的項(xiàng)目，通過該項(xiàng)目的實(shí)施，已在肺癌、乳腺癌等50種癌癥的上萬(wàn)個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)了近1千萬(wàn)種遺傳變異。目前學(xué)術(shù)界達(dá)成這樣一個(gè)共識(shí),防治腫瘤的首要任務(wù)是了解腫瘤細(xì)胞的基因變異。

美國(guó)的國(guó)家癌癥研究所在2017開展了一次全國(guó)癌癥精確醫(yī)學(xué)問卷調(diào)查（National Survey of Precision Medicinein Cancer Treatment），其調(diào)查結(jié)果顯示：在參加調(diào)查的美國(guó)腫瘤醫(yī)生中，高達(dá)75.6%都在用“二代測(cè)序”技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS）指導(dǎo)腫瘤治療，其中34.0%的醫(yī)生經(jīng)常使用NGS檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)晚期難治性腫瘤患者的治療決定，29.1%的醫(yī)生通過NGS檢測(cè)決定腫瘤患者是否有資格進(jìn)行臨床試驗(yàn)，17.5%的醫(yī)生用NGS檢測(cè)來(lái)決定超適應(yīng)癥用藥。

基因測(cè)序目前已經(jīng)成為一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)。根據(jù)美國(guó)聯(lián)合市場(chǎng)研究機(jī)構(gòu)在2017年年底發(fā)布的分析報(bào)告，2016年全球DNA測(cè)序市場(chǎng)約為52億美元，預(yù)計(jì)到2023年達(dá)到183億美元。顯然，腫瘤患者的基因檢測(cè)需求在這個(gè)測(cè)序市場(chǎng)占有重要的份額；例如，美國(guó)已經(jīng)有數(shù)百萬(wàn)女性接受了抑癌基因BRCA1的基因變異檢測(cè)，以判定個(gè)體患乳腺癌或卵巢腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)程度。此外，越來(lái)越多的腫瘤基因檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)入了臨床應(yīng)用領(lǐng)域；例如，2017年12月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了首個(gè)腫瘤基因檢測(cè)盒上市；這款由波士頓一家生物公司“Foundation Medicine”制造的產(chǎn)品“Foundation One CDx”，通過對(duì)324 個(gè)特定的腫瘤基因的深度測(cè)序來(lái)檢測(cè)變異情況，從而對(duì)肺癌、乳腺癌、直腸癌和卵巢癌等四種常見的惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因測(cè)序技術(shù)也正在發(fā)生著重大的改進(jìn)。由于NGS技術(shù)的測(cè)定序列“讀長(zhǎng)”較短，通常在200-300bp；研究者又開發(fā)了第三代測(cè)序技術(shù)，其“讀長(zhǎng)”平均能達(dá)到10Kb以上。研究者利用第三代測(cè)序技術(shù)能夠進(jìn)一步揭示出腫瘤細(xì)胞基因組的變異特征和復(fù)雜性。例如在一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的測(cè)序工作中，作者利用第三代測(cè)序技術(shù)鑒定出17313個(gè)長(zhǎng)度大于50bp的基因組結(jié)構(gòu)變異，包括插入、缺失、重復(fù)、倒位和其它特殊變異類型；而用NGS技術(shù)只檢測(cè)到了4174個(gè)基因組結(jié)構(gòu)變異^[1]?？梢姷谌鷾y(cè)序技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)上具有更高的靈敏度與準(zhǔn)確度。

雖然研究者利用先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中大量的基因變異，但是研究者對(duì)這些基因變異的生物學(xué)意義或在腫瘤的發(fā)生發(fā)展的病理作用方面仍知之甚少。例如研究者已經(jīng)在與乳腺癌或卵巢癌高度相關(guān)的抑癌基因BRCA1的13個(gè)外顯子上發(fā)現(xiàn)了近4千種單核苷酸變異（Single-nucleotide variants，SNVs），但大部分SNV的生物學(xué)含義或者在癌變中的作用并不是很清楚。不久前研究者采用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)系統(tǒng)性地評(píng)估了整個(gè)BRCA1的外顯子序列上幾乎所有的SNV，鑒定出400多個(gè)SNV屬于非功能性錯(cuò)義突變（non-functional missense），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了能夠抑制BRCA1表達(dá)的近300個(gè)SNV^[2]。可以認(rèn)為，確定基因變異在腫瘤中的作用依然是當(dāng)前基因檢測(cè)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。

需要指出的是，即使知道了腫瘤細(xì)胞里基因突變的作用或功能，也并不就意味著能夠給患者帶來(lái)益處。一項(xiàng)對(duì)5千多例非小細(xì)胞肺癌患者的基因檢測(cè)方式與生存率的相關(guān)性研究揭示，那些接受了30種基因以上的“廣譜基因”檢測(cè)的患者與只接受了單純的EGFR/ALK檢測(cè)的患者在12個(gè)月生存率上沒有顯著差異^[3]。研究者發(fā)現(xiàn)，除了針對(duì)EGFR/ALK相關(guān)的靶向治療之外，在攜帶其他類型基因突變的患者中只有4.5%的人得到了相應(yīng)的靶向治療^[3]。換句話說(shuō)，檢測(cè)到了有臨床意義的突變不等于獲得了有效的治療藥物。當(dāng)前的基因檢測(cè)能力已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人們研發(fā)靶向藥物的能力。

追蹤腫瘤動(dòng)態(tài)變化的利器：液體活檢

腫瘤最具挑戰(zhàn)性的特點(diǎn)除了高度異質(zhì)性之外就是高度可變性，即腫瘤細(xì)胞隨著病程或者治療過程時(shí)刻發(fā)生著各種各樣的變化。這個(gè)特點(diǎn)使得傳統(tǒng)的病理診斷或者影像診斷難以滿足治療腫瘤的需求，迫切需要一個(gè)能夠無(wú)創(chuàng)地動(dòng)態(tài)跟蹤腫瘤細(xì)胞變化的檢測(cè)技術(shù)。液體活檢技術(shù)就是一個(gè)用來(lái)滿足這種需求的檢測(cè)技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)可能是近年來(lái)在臨床上,尤其在腫瘤診治領(lǐng)域發(fā)展最快的檢驗(yàn)方法，曾被《麻省理工科技評(píng)論》評(píng)選為“2015年十大突破技術(shù)”。該項(xiàng)技術(shù)通過非侵入性方式檢測(cè)血液或尿液等體液中特定的生物標(biāo)志物，從而對(duì)癌癥等疾病做出相應(yīng)的診斷。目前腫瘤液體活檢的分析重點(diǎn)是血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating  tumor cells，CTCs）、循環(huán)腫瘤DNA  （circulating tumor DNA，ctDNA）、 以及腫瘤細(xì)胞分泌的含有核酸、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的囊泡狀外泌體（exosome）^[4]。

對(duì)血液中的CTC和ctDNA進(jìn)行檢測(cè)是目前臨床應(yīng)用中最常見的液體活檢形式，尤其是ctDNA作為監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程和藥物響應(yīng)的生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。首先，通過對(duì)ctDNA的分析能夠提供對(duì)腫瘤基因組的綜合性信息以及找到往往在病理組織活檢中無(wú)法發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變，從而可以用于判斷腫瘤對(duì)藥物的敏感性或耐藥性，如從非小細(xì)胞肺癌患者的ctDNA中檢測(cè)到EGFR基因突變就可以用于指導(dǎo)臨床用藥。此外，通過對(duì)ctDNA的深度測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)只在部分腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的基因突變，從有助于解決腫瘤組織的內(nèi)部異質(zhì)性問題。

雖然液體活檢技術(shù)在臨床上得到迅速的推廣，但是該方法的臨床有效性并沒有得到很好的研究。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)和美國(guó)病理醫(yī)師學(xué)會(huì)對(duì)已經(jīng)發(fā)表的1338篇臨床關(guān)于ctDNA檢測(cè)的論文從分析有效性（analytical validity）、臨床有效性（clinical validity）和臨床實(shí)用性（clinical utility）三個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)地分析^[5]。該項(xiàng)分析指出，目前發(fā)表的與ctDNA分析有效性相關(guān)的研究都是通過比較腫瘤組織和血漿中致病突變的一致性而得出結(jié)論，但實(shí)際上有很多生物學(xué)因素會(huì)影響到這種一致性；此外，ctDNA檢測(cè)到的陽(yáng)性結(jié)果可以用于指導(dǎo)臨床治療，但檢測(cè)結(jié)果為陰性的患者仍然需要做腫瘤組織檢測(cè)，因?yàn)檫@類陰性結(jié)果的病人在組織病理檢測(cè)中可能是陽(yáng)性結(jié)果。盡管當(dāng)前研究者很看重ctDNA的檢測(cè)潛力，但是在付諸日常臨床實(shí)踐時(shí)尚需要更多的臨床有效性證據(jù)”^[5]。

液體活檢技術(shù)除了關(guān)注血液中的CTC和ctDNA之外，還涉及到了血液中RNA和蛋白質(zhì)等其它組分。血液蛋白質(zhì)在過去的臨床實(shí)踐中已經(jīng)被視為重要的生物標(biāo)志物來(lái)源，其中就有數(shù)十種腫瘤抗原或腫瘤分泌蛋白被廣泛用于診斷腫瘤發(fā)生或判斷治療效果和預(yù)后；近年來(lái)研究人員利用蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展出了針對(duì)血液蛋白質(zhì)的液體活檢技術(shù)^[6]。顯然，如何把血液中各種組分充分用于腫瘤液體活檢是研究者需要認(rèn)真考慮的問題。

腫瘤的分子分型：基于生物標(biāo)志物的兩種策略

傳統(tǒng)的腫瘤分類是基于解剖位置和病理性狀，屬于“粗放型”。由于腫瘤存在高度的異質(zhì)性，相似病理形態(tài)的腫瘤往往會(huì)表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和不同的藥物響應(yīng)。隨著精確醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)，研究者逐漸將基因和蛋白質(zhì)等生物大分子作為腫瘤分類的基礎(chǔ)。而分子分型的結(jié)果也在抗腫瘤藥物的研發(fā)中起到了重要的作用。例如，在原創(chuàng)藥Larotrectinib（原肌球蛋白受體激酶TRK的小分子抑制劑）的臨床試驗(yàn)中，入選的患者涉及到13種不同的實(shí)體瘤類型，但每個(gè)患者都有一個(gè)共同的分子標(biāo)志物——TRK基因的融合變異。

腫瘤細(xì)胞的基因變異信息目前是腫瘤分子分型最常用的分子標(biāo)志物；美國(guó)在啟動(dòng)“癌癥基因組圖集”（TCGA）項(xiàng)目時(shí)，從其名稱就可以看到是把腫瘤的分類目標(biāo)定在腫瘤細(xì)胞的基因組測(cè)序。但是，研究者很快就認(rèn)識(shí)到，單一的基因變異分子特征很難應(yīng)用于大部分癌癥類型。美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）TCGA項(xiàng)目尚在進(jìn)行中又啟動(dòng)了一個(gè)針對(duì)腫瘤蛋白質(zhì)組的項(xiàng)目“the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium” (CPTAC)，不僅要獲得腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，而且要把基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行分析；研究者為此專門創(chuàng)造了一個(gè)詞“蛋白質(zhì)組-基因組學(xué)”（proteogenomics）。該項(xiàng)目的第一篇研究論文于2014年發(fā)表。在此項(xiàng)研究中，研究者首先把已經(jīng)被TCGA進(jìn)行過基因組測(cè)序的95個(gè)人類結(jié)直腸癌樣本做了蛋白質(zhì)組分析，然后將這些蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，進(jìn)而更完整地揭示了這些腫瘤細(xì)胞的分子特性^[7]。

隨著研究工作的深入，人們發(fā)現(xiàn)不同類型的生物大分子乃至其化學(xué)修飾在腫瘤鑒定和分類中都有著特定的價(jià)值，例如不久前發(fā)表的一項(xiàng)工作，利用改進(jìn)的液體活檢技術(shù)分析了血液中游離DNA（Cell-freeDNA, cfDNA）的甲基化信息，成功地進(jìn)行了早期腫瘤檢測(cè)并作了正確的分類^[8]。

顯然，要實(shí)現(xiàn)腫瘤的精確分子分型，并用來(lái)指導(dǎo)個(gè)性化抗腫瘤藥物的研發(fā)，研究者必須改變那種依賴于單一類型生物標(biāo)志物乃至單個(gè)分子標(biāo)志物的簡(jiǎn)單化思路，發(fā)展基于多個(gè)生物標(biāo)志物指標(biāo)的整合型評(píng)估技術(shù)，通過建立特定的評(píng)估模型來(lái)確定不同指標(biāo)之間的權(quán)重分配和進(jìn)行多指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)分析，從而能夠確定個(gè)體患者的腫瘤分子特征以及預(yù)測(cè)其可能的藥物響應(yīng)情況。例如，TCGA項(xiàng)目的研究者在腫瘤分子分型方面，不僅利用了腫瘤細(xì)胞基因組序列的信息，而且還整合了相關(guān)的染色體非整倍性、DNA甲基表達(dá)譜、基因表達(dá)譜、microRNA表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜等數(shù)據(jù)，從而將傳統(tǒng)分類確定的33種腫瘤類型按照這種多組學(xué)整合的分子分型方法分為了28種類型^[9]。

腫瘤分子分型的目標(biāo)，不僅是要找出具有相同病理形態(tài)的腫瘤的不同分子特征，而且還要提煉出不同病理形態(tài)的特定類型腫瘤的共同分子特征，即構(gòu)造一種稱為“泛腫瘤”（pan-cancer）的類型。不久前，美國(guó)研究人員采集了年齡20歲或以下的6種白血病和實(shí)體瘤的青少年腫瘤（paediatric cancers）近1千7百例樣本，檢測(cè)了其全基因組、全外顯子組和轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)了一系列青少年腫瘤基因組所共有的特征，如在這些樣本中找到了142個(gè)驅(qū)動(dòng)基因，其中只有45%能夠在成人各種類型的腫瘤中找到^[10]。又例如，研究者收集了卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、子宮肌瘤和乳腺癌共2千5百多例樣本，對(duì)這些樣本的基因組、表觀遺傳組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，從而發(fā)現(xiàn)了16種與臨床相關(guān)的分子特征，在此基礎(chǔ)上對(duì)泛婦科腫瘤進(jìn)行了綜合分子分型，得到了與預(yù)后和靶向治療顯著相關(guān)的5種分子亞型^[11]。

由此可以看出腫瘤分子分型的兩個(gè)主要策略：基于特定分子標(biāo)志物的“跨瘤種”分子分型，以及基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合的“泛腫瘤”分子分型。前者注重不同腫瘤類型間的分子個(gè)性特征，后者注重具有特定生物學(xué)共性（如“青少年腫瘤”或“婦科腫瘤”）的不同腫瘤類型間的分子綜合信息。二者都超越了基于組織病理形態(tài)特征的傳統(tǒng)腫瘤分類，從分子層面揭示出各種腫瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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