使用染色質(zhì)免疫沉淀，然后測(cè)序或ChIP-seq，可以分析全基因組的DNA結(jié)合蛋白，組蛋白修飾和核小體。ChIP-seq文庫(kù)的制備允許研究基因調(diào)控和表觀遺傳機(jī)制。

成功的ChIP-seq庫(kù)準(zhǔn)備

標(biāo)準(zhǔn)DNA文庫(kù)制備與ChIP-seq文庫(kù)制備沒(méi)有什么不同。存在幾種商業(yè)方法，通常適用于稱為Illumina測(cè)序的下一代測(cè)序平臺(tái)，其也可用于標(biāo)準(zhǔn)DNA文庫(kù)制備。其他新一代測(cè)序平臺(tái)包括Helicos，Roche和ABI。標(biāo)準(zhǔn)和ChIP-seq文庫(kù)制備之間的一個(gè)區(qū)別是輸入DNA的量，ChIP-seq文庫(kù)通常較低。
所有ChIP實(shí)驗(yàn)都集中在結(jié)合DNA的蛋白質(zhì)上，因此首先將DNA結(jié)合蛋白與DNA交聯(lián)。這通常使用甲醛完成，然后進(jìn)行超聲誘導(dǎo)剪切。這產(chǎn)生200至600bp范圍內(nèi)的小片段。針對(duì)靶蛋白產(chǎn)生的抗體用于免疫沉淀DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合物。然后反轉(zhuǎn)交聯(lián)，并將片段化的游離DNA用于文庫(kù)制備。
Illumina的文庫(kù)制備通常遵循相同的概要。由片段化DNA組成的輸入經(jīng)歷處理以修復(fù)末端并使5'末端磷酸化。在此之后，連接所選擇的銜接子并切除該銜接子的尿嘧啶部分。PCR用于富集和鏈重復(fù)，清理產(chǎn)物并構(gòu)建文庫(kù)。

關(guān)于ChIP-seq庫(kù)準(zhǔn)備的建議

為了構(gòu)建具有良好覆蓋率和低偏差的文庫(kù)，需要高質(zhì)量的DNA和適當(dāng)?shù)奈膸?kù)制備。在制備期間，通過(guò)使用低保留管可以最大化樣品回收，這使得DNA與實(shí)驗(yàn)室塑料器皿的結(jié)合最小化。

所有試劑應(yīng)在制備庫(kù)的當(dāng)天新鮮制備。類似地，文庫(kù)制備中使用的酶傾向于在室溫下具有高降解速率，這意味著它們需要始終在合適的溫度下儲(chǔ)存以確保反應(yīng)效率。
必須在文庫(kù)制備之前進(jìn)行DNA定量。建議使用熒光計(jì)進(jìn)行定量，因?yàn)榕c光譜儀相比，使用嵌入染料定量DNA的技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確度和更高的靈敏度。應(yīng)使用生物分析儀，先進(jìn)行文庫(kù)制備，然后再驗(yàn)證樣本大小分布。
使用高靈敏度的DNA試劑盒以確保DNA定量和鑒定準(zhǔn)確是很重要的。在文庫(kù)制備中使用的適配器將增加樣品的重量，并且在尺寸選擇期間應(yīng)該考慮。
在測(cè)序之前，應(yīng)清潔制備中的文庫(kù)并選擇大小以除去不需要的DNA片段，例如未連接的引物或引物二聚體。DNA清理還應(yīng)該消除長(zhǎng)度低于200 bp的任何DNA片段。
在合成文庫(kù)之前，建議分析免疫沉淀的DNA。這是使用qPCR進(jìn)行的，其中對(duì)于根據(jù)需要選擇的特定基因具有最少一個(gè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照靶。
ChIP-seq需要一個(gè)對(duì)照來(lái)比較序列分析中的峰，因此必須在文庫(kù)旁邊準(zhǔn)備對(duì)照。雖然沒(méi)有普遍認(rèn)同的控制作為最佳控制，但最常見(jiàn)的控制使用以下之一：
輸入DNA或未經(jīng)免疫沉淀的DNA
模擬DNA，或在免疫沉淀過(guò)程中未用抗體處理的DNA
非特異性的，或已知不與DNA相互作用的抗體
由于ChIP-seq使用抗體，實(shí)驗(yàn)可能會(huì)受到抗體使用的限制。最好的文庫(kù)將使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體構(gòu)建，因?yàn)槟承┛贵w與下一代測(cè)序平臺(tái)不兼容。