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專利名稱：一種治療腫瘤的中藥組合物的制作方法 技術(shù)領(lǐng)域： 本發(fā)明涉及一種治療治療腫瘤的中藥組合物，具體地說是由人參、靈芝、斑蝥和干蟾皮組成的藥物組合物。 背景技術(shù)： 近年來隨著我國對中藥抗腫瘤的重視和深入，如何利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究手段探討并尋找中藥抗腫瘤活性成分和明確其腫瘤作用機制成為研究的重點和熱點領(lǐng)域。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對腫瘤的認識歷史悠久，經(jīng)典著作《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對腫瘤有“除積之藥，知在攻補之益”的論述，特別是對“毒、瘀、虛”理論在腫瘤方面的內(nèi)在病理有廣泛的應(yīng)用，可見，中醫(yī)理論對腫瘤治療強調(diào)“扶正祛邪”、“解毒祛瘀”、“陰陽平衡”的辨證施治。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點來看，扶正祛邪的根本目的在于改善和恢復(fù)機體神經(jīng)—體液調(diào)節(jié)，增強免疫調(diào)節(jié)，從而殺死體內(nèi)的惡性腫瘤細胞，手術(shù)、放療、化療雖然都是祛邪抗癌的有效手段，但著眼于消滅癌性病灶，勢必會造成機體氣血耗傷，臟腑功能紊亂失調(diào)，相反，中醫(yī)著眼于整體，在祛邪抗癌同時給予扶正培本以達到攻補兼施。 扶正固本藥，調(diào)節(jié)機體免疫功能狀態(tài)，使機體的抗腫瘤免疫功能得以加強是中藥抗腫瘤機制之一。眾所周知，腫瘤的發(fā)生與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，免疫力降低可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、惡化和轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，祖國醫(yī)學(xué)認為“正氣不足，而邪氣距之，積之成也”。對腫瘤的治療也須祛邪與扶正并舉，才能發(fā)揮更好的療效，腫瘤患者機體免疫功能常常處于低下狀態(tài)，而提高免疫功能能夠提高機體識別異己能力，達到殺滅腫瘤的目的。 本類藥物多具補益功能，毒性低，患者易耐受，對體質(zhì)虛弱的中晚期癌癥患者具有良好的臨床效果。主要有人參、黃芪、淫羊藿、山茱萸、何首烏、黃精、甘草、肉蓯蓉、杜仲等。目前研究較為深入的有人參皂甙Rg3，最近研究表明，Rg3不僅具有抑制腫瘤生長作用，而且還有抑制腫瘤血管生成、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)作用。另外還有許多近年來研究的熱點中藥提取物多糖，如靈芝、枸杞子、黃芪、冬蟲夏草、豬苓、茯苓等，實驗研究表明，云芝多糖對小鼠S180、腹水型肝癌等均有抑制作用，另有報道，云芝多糖還可以誘導(dǎo)IL-2、IL-6等多種細胞因子的產(chǎn)生；人參多糖、紅芪多糖分別能增加特異性體液及細胞免疫功能，如INF、NK等。 活血祛瘀藥，眾多研究表明，大多數(shù)癌癥患者均存在高凝狀態(tài)，而且此種狀態(tài)與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，活血化瘀藥物是近幾年被逐漸認同的腫瘤輔助用藥，可以改善癌癥患者的高凝狀態(tài)，目前研究較多的是川芎、丹參、莪術(shù)、牛膝、姜黃、乳香、王不留行等。其中，川芎嗪可以明顯抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移；乳香中的乙酰乳酸對人早幼白血病細胞HC-60有明顯分化誘導(dǎo)作用，美國曾對302種中藥進行篩選，發(fā)現(xiàn)很多活血化瘀藥物(如紅花、王不留行、蘇木等)水提液對多種瘤株具有殺傷作用，其中以蘇木作用最強，特別是對K562、L929、Yac-1具較強殺傷力，對EAC、P383、L2110具有明顯生命延長率。但效果并不顯著。 清熱解毒藥，誘導(dǎo)細胞凋亡是目前研究最為熱點的中藥抗腫瘤機制，越來越多的證據(jù)表明中藥抗腫瘤的療效與中藥誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)。清熱解毒類藥物一方面可以具有抗癌特性，另一方面可以緩解患者腫瘤熱癥狀、治療并發(fā)的感染、提高免疫功能。如苦參、白花蛇舌草、山豆根、斑蟊、長春花、冬凌草、穿心蓮、黃芩、天花粉、夏枯草等，這類藥物作用于癌細胞生長的不同階段，如苦參可以影響蛋白質(zhì)合成、干擾癌細胞能量代謝；斑蟊可以促進癌細胞凋亡，破壞癌細胞膜，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡；黃芩提取物黃芩新素，體外對L1201瘤株ED50為1.5μg/ml，黃芩的另一種成分白楊素對鼻咽癌細胞有明顯的殺傷作用。有些植物中藥在廣泛臨床和體內(nèi)外動物實驗研究基礎(chǔ)上，經(jīng)過提純成為化療藥物，如長春花提取的長春堿、冬凌草提取的冬凌堿、紫杉樹皮提取的紫杉醇(泰索帝)、砒霜中提取的亞砷酸等，成為目前臨床常用的化療藥，引起國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。其毒性也是明顯的。 瀉下藥，研究較多的中藥有巴豆、大戟、蘆薈、商陸等，這類中藥是一組毒性較大的中藥，而且在臨床中也有一定的爭議，如巴豆中提取的TPA是一種強促癌劑，但它對HL-60細胞卻有顯著的誘導(dǎo)分化作用，巴豆的另一抗癌有效成分為一糖蛋白moguin，分子量為9000，其中單鏈蛋白質(zhì)專屬抗癌活性，對正常細胞無效。另外，商陸多糖、蘆薈甘露聚糖等均有研究證明具有明顯的抗癌作用。 在中藥中還有很多的中藥如山楂、真菌類多糖、紫菀、鯊魚軟骨素及其一些復(fù)方等均有研究證明具有抗癌活性成分。還有一些可以明顯減輕放化療的副作用及增敏作用。這些研究表明，以中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)的中藥抗癌研究是可行的，而且各類中藥的抗癌活性成分與各類中藥的藥理藥性密切相關(guān)。 在尋找有效的抗癌藥物方面，世界范圍內(nèi)都投入了大量的人力、物力，但到目前為止，還沒有一種藥物能將某種腫瘤治愈，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的原因至今未明，這為中醫(yī)藥治療腫瘤的研究帶來極大的困難，因此中醫(yī)藥研究更注重的是辨證論治和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的多靶向，近幾年來研究證明，無論是在抑制、殺傷腫瘤細胞，調(diào)節(jié)機體免疫功能，改善癥狀和體征，還是減輕放化療副作用，中醫(yī)藥均發(fā)揮了重要的作用。 植物中提取有效成分，包括長春堿類(長春堿、長春新堿、長春酰胺、長春瑞賓等)、喜樹堿類(喜樹堿、羥基喜樹堿)、欖香烯、由苡米仁中提取的康萊特、豬苓多糖、仙靈多糖、黃芪多糖和人參皂甙等。從中藥青黛中提取的有些成分對慢性白血病有效，以后又半合成了療效進一步提高。從植物三尖杉中提取的三尖杉酯堿和高三尖杉堿對急性非細胞細胞白血病有突出療效，目前在國際上作為三線藥物應(yīng)用。應(yīng)用維甲酸制劑和三氧化二砷治療白血病是我國臨床腫瘤學(xué)家的創(chuàng)舉，目前已經(jīng)得到國際上承認廣泛應(yīng)用。我國在應(yīng)用中藥復(fù)方作為輔助治療具有一定現(xiàn)實應(yīng)用意義，也經(jīng)國際同行廣泛驗證。近年來我國在研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥也有一些成績，例如CN200410037110，cn200410051412，CN200410004443，CN03117114。上市產(chǎn)品如艾迪、康萊特、鴨膽子油、得力生注射液、復(fù)方苦參參注射液、復(fù)方斑蝥注射液等，單一成分如參一膠囊(人參皂甙Rg3)有較好的臨床效果。 但是，上述產(chǎn)品的臨床應(yīng)用還不盡人意，如艾迪主要的毒性反應(yīng)為肝、腎功能損害，對心臟毒性反應(yīng)也有報道。臨床發(fā)現(xiàn)有低熱現(xiàn)象，對注射部位有一定的刺激或引起靜脈炎，致使滴速減慢。個別患者可在輸液過程中有惡心欲吐的胃腸道反應(yīng)，另外極個別會出現(xiàn)面紅、蕁麻疹、胸悶等皮疹和呼吸困難的不良反應(yīng)。得力生注射液主要的臨床報道都是輔助放化療。 本發(fā)明由人參、靈芝、斑蝥和干蟾皮組成，方中人參、靈芝扶正固本，增強腫瘤病人的抗癌能力，減輕放化療的副作用及增敏作用。干蟾皮、斑蟊攻堅解毒，破瘀散結(jié)，為中藥中的最強的抗癌中藥，攻補相互配合，相得益彰。經(jīng)動物藥理實驗證明比現(xiàn)有制劑有更好的療效，更低的不良反應(yīng)。 干蟾皮為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictrs Sc-hneider等的皮。成分一般與蟾酥相似，華蟾素注射液臨床應(yīng)用多年。但其毒性大。 斑蝥為芫青科昆蟲南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黃黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥體。具有抗癌作用的藥物，抑制DNA和RNA合成，對肝臟和癌細胞有較強的親和性，對原發(fā)性肝臟及其他癌癥有效，且無骨髓抑制作用，同時還具有升高白細胞數(shù)，抗病毒，抗炎作用。但其毒性大。 人參為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。栽培者為“園參”，野生者為“山參”。人參皂甙Rg3可作用于細胞生殖周期的G2期，抑制癌細胞有絲分裂前期蛋白質(zhì)和ATP的合成，使癌細胞的增殖生長速度減慢，并且具有抑制癌細胞浸潤、抗腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞生長等作用。人參皂甙Rh具有抑制中樞神經(jīng)、催眠作用，鎮(zhèn)痛、安神、解熱、促進血清蛋白質(zhì)合成作用，抑制中性脂肪分解、促進類胰島素成分合成、促進膽固醇生物合成、活化、促進DNA合成作用。人參皂甙Rh2具有抑制癌細胞向其它器官轉(zhuǎn)移，增強機體免疫力，快速恢復(fù)體質(zhì)的作用。對癌細胞具有明顯的抗轉(zhuǎn)移作用，可配合手術(shù)服用增強手術(shù)后傷口的愈合及體力的恢復(fù)。人參多糖對環(huán)磷酰胺所致小鼠巨噬細胞吞噬功能抑制、溶血素形成抑制和遲發(fā)型超敏反應(yīng)抑制均有恢復(fù)正常的作用，可使負荷S180小鼠脾臟溶血空斑形成細胞(PFC)、特異玫瑰花形成細胞(SRFC)、血清抗SRFC抗體和脾細胞抗體分泌量明顯增加。人參多糖對受X射線一次全身照射的小鼠預(yù)防給藥，有明顯的抗輻射損傷作用，提高照射動物30天存活率。人參多糖還可明顯抑制小鼠艾氏腹水癌細胞增生，對S180有顯著體內(nèi)抗腫瘤作用，尤其與化療藥物環(huán)磷酰胺合用效佳。人參多糖還具有清除超氧自由基及羥自由基作用。但目前還沒有一種制劑含較高量二醇組皂苷和人參多糖。 靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體。靈芝多糖能顯著提高吞噬細胞的吞噬能力；增強細胞免疫功能，提高紅細胞中超氧化物歧化酶SOD的活性；對人體具有顯著的抑制腫瘤作用；增加人體器官細胞的活力，促進新陳代謝，排除體內(nèi)毒素；現(xiàn)有靈芝多糖的制劑上市。三萜類化合物能抑制細胞組胺釋放。但是現(xiàn)在還有一種制劑既含多糖，又含三萜類化合物。 本發(fā)明的藥理實驗證明本發(fā)明的的制劑具有清熱解毒、消瘀散結(jié)的功能，適用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴癌、婦科惡性腫瘤等疾病的治療，各類腫瘤術(shù)后的鞏固治療，也可以與放、化療配合使用，增效減毒，與現(xiàn)有技術(shù)相比其治療效果更明顯，毒性更低。 發(fā)明內(nèi)容 經(jīng)過我們大量的科學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了人參、靈芝、斑蝥和干蟾皮組成的藥物組合物有很強的治療腫瘤疾病的作用，并對此發(fā)明做了進一步的完善，將這種組合物制成便于臨床實施應(yīng)用的藥物制劑。 本發(fā)明的一個目的是提供一種具有清熱解毒、消瘀散結(jié)的功能，適用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴癌、婦科惡性腫瘤等疾病的治療，各類腫瘤術(shù)后的鞏固治療，也可以與放、化療配合使用，增效減毒，與現(xiàn)有技術(shù)相比其治療效果更明顯，毒性更低。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備以上組合物的生產(chǎn)工藝。 人參提取物的制備取人參粗粉500g，加5000ml 70％乙醇回流提取三次(第一次浸泡過夜)，每次1小時，合并三次提取液，濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至稠膏每1ml相當(dāng)于原生藥2g的溶液，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，加乙醇溶液使含醇量達90％，取上清液，減壓回收乙醇，濃縮至相當(dāng)于生藥材1∶1，加水稀釋至1000ml，用10％鹽酸溶液調(diào)pH值7左右，冷藏12小時，濾過，濾液上已處理好的D101大孔吸附樹脂柱(樹脂用量與藥材比為1∶5)，依次用4000ml水和25％乙醇4000ml洗脫，棄去洗脫液，再用70％乙醇溶液4000ml洗脫，收集洗脫液，濾過，回收乙醇，濃縮至每1ml相當(dāng)于原生藥5g的稠膏，于100℃減壓干燥，即得人參提取物，備用。 靈芝提取物的制備取靈芝5kg，超微粉碎，用水50L50℃超聲提取2次，每次20分鐘，合并提取液，過濾，濾液減壓干燥，即得靈芝提取物，備用。 斑蝥提取物的制備稱取斑蝥2kg，加入20L倍量125mmol/L氫氧化鈉溶液，超聲波發(fā)生器中，功率600kHz超聲提取2次(25，15min)。提取液濾過，合并濾液，以3000r/min離心10min，上清液水浴濃縮至20L，減壓干燥即得。 干蟾皮提取物的制備采用溶媒提取法，將蟾酥1kg粉碎成細粉，用90％乙醇滲漉至無色，殘渣繼續(xù)用80％乙醇滲漉至無色，合并滲漉液。減壓濃縮至浸膏狀。10L水溶解，靜置48小時。取上清液，干燥即得。 本發(fā)明的藥物組合物的配方如下人參1-98.6％、靈芝1-98.6％、斑蝥0.2-98.6％、干蟾皮0.2-98.6％。 采用現(xiàn)有的醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的制劑技術(shù)，可以將上述配方的藥物組合物制成各種適合臨床使用的藥物劑型。以下內(nèi)容為驗證本發(fā)明藥物組合物(組合物一為實例2，組合物二為實例3)的藥理學(xué)結(jié)果一、免疫功能1-1材料1-1-1試劑刀豆蛋白A(ConA)為美國SIGMA公司產(chǎn)品；RPMI-1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品；3H-甲基胸腺嘧啶核苷(OH.TDR)由中國原子能科學(xué)研究院生產(chǎn)；IL-2試劑盒由北京東亞免疫技術(shù)研究所提供；1-1-2動物分組及給藥昆明種小鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號川實動管質(zhì)2004-15。所有動物隨機分成正常對照組、本專利組合物一高、低劑量組(簡稱組合物一高、低劑量組)、艾迪注射液組；組合物一高、低劑量組小鼠分別注射本專利組合物一16.67、8.33mg/kg，分別為臨床用量的10、5倍；組合物二組小鼠分別注射本專利組合物二20mg/kg，相當(dāng)于擬定臨床劑量的10倍；艾迪注射液組注射艾迪注射液16.67ml/kg，連續(xù)用藥7d，正常對照組以等容積蒸餾水代替，于第8天處死，制備脾細胞懸液。 1-1-3營養(yǎng)液RPMI-1640中加入體積分數(shù)為10％的小牛血清、25mmol/L HEPES、2g/L NaHCO3、100mg/L青霉素、100mg/L鏈霉素。 1-1-4細胞株小鼠成纖維細胞(L929)由珠江醫(yī)院血液科提供，連續(xù)4d常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，實驗前1d換液，實驗時用2.5g/L胰蛋白酶1～2mL消化1～2min，收集細胞，調(diào)細胞濃度至2×108/L，活細胞數(shù)大于95％，即為備用的NK靶細胞。 1-2方法1-2-1小鼠脾細胞懸液制備實驗用小鼠摘眼球放血，頸椎脫位法處死后，無菌取脾，在100目銅網(wǎng)上輕輕擠壓，制成脾細胞懸液，用低滲法除去紅細胞，以不含血清的1640培養(yǎng)液洗滌2次，將細胞重懸于RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，配成1×1010/L脾細胞懸液，作為效應(yīng)細胞。 1-2-2小鼠脾細胞IL-2誘生取小鼠脾細胞懸液接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)，1ml/孔，再加ConA 5mg/L，置于37~C、體積分數(shù)為5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，離心后收集上清，于一20~C保存?zhèn)溆谩?br>1-2-3IL-2活性測定采用放射免疫測定(RIA)法，按試劑盒說明書操作。 1-2-4NK細胞活性測定取上述靶細胞懸液，加入96孔平底培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，放入37℃、體積分數(shù)為5％CO2孵箱中孵育4h，使靶細胞貼壁成一單層細胞，再向每孔加0.1mL效應(yīng)細胞，同時設(shè)效應(yīng)細胞對照孔，再放入37℃、體積分數(shù)為5％CO2孵箱中孵育24h，實驗結(jié)束前1h傾去上清液，用牛理鹽水輕輕灌滿各孔，反復(fù)3次以除去效應(yīng)細胞及被效應(yīng)細胞殺傷而脫落下來的靶細胞，在濾紙上吸1孔內(nèi)水份，每孔加入1g/L中性紅染液0.1ml，37℃、體積分數(shù)為5％CO2孵箱中孵育1h，棄去染液，用生理鹽水洗3遍。每孔加入0.1mL細胞溶解液(體積分數(shù)為50％冰醋酸和50％無水乙醇配制)，溶解留下的靶細胞，5min后輕輕搖勻，用酶標儀在490nm處測定光密度(D)，參考波長為450nm，以留下靶細胞的D值表示NK活性，并汁算NK細胞殺傷率Pnk＝(I-D實驗孔)/D對照孔×100％1-2-5脾淋巴細胞增殖測定取小鼠脾細胞懸液100ul/孔，同時加入濃度為5mg/L的ConA100uL，對照組加入200ul RPMI-1640，每孔設(shè)3個復(fù)孔，置37℃、體積分數(shù)為5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)66h，每孔20ul摻入H-TDR 18 500Bq，繼續(xù)培養(yǎng)至72h，收集細胞于49型玻璃纖維濾紙上，80℃烘干30min，在液體閃爍計數(shù)器上測每分鐘計數(shù)(CPM)，計算平均值，并以下列公式計算脾淋巴細胞增殖指數(shù)I＝n實驗孔/n對照孔1-3結(jié)果1-3-1本專利組合物一對小鼠NK活性的影響結(jié)果見表1。 表1 本專利組合物一對小鼠NK細胞活性的影響 注*與對照組比較P＜0.05；**與對照組比較P＜0.011-3-2本專利組合物一對小鼠IL-2生成能力及脾淋巴細胞增殖的影響結(jié)果見表2。 表2 本專利組合物一對小鼠IL-2生成能力及脾臟淋巴細胞增殖的影響 注*與對照組比較P＜0.05；**與對照組比較P＜0.01實驗結(jié)果表明，本專利組合物一、組合物二能增強NK細胞活性和IL-2生成能力，促進脾淋巴細胞增殖，與對照組比較有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；增強NK細胞殺傷率，并呈劑量相關(guān)性，高劑量組稍優(yōu)于陽性對照藥艾迪注射液；表明本專利組合物一、組合物二均能促進機體免疫功能。 二、大鼠肝癌實驗研究1材料與方法1.1材料 手術(shù)顯微鏡、顯微外科手術(shù)包1.2動物及瘤株 雄性SD大鼠，體重200~250g，購自四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，合格證號川實動管質(zhì)2004-15。walker一256瘤株由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院提供。 1.3大鼠移植性肝癌模型的建立參照文獻大鼠移植性肝癌模型的制作(李琦，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報)建立大鼠移植性肝癌模型。 1.4給藥本專利組合物一低中高劑量組分別腹腔注射液本專利組合物一8.3mg/kg、16.7mg/kg、25mg/kg；陽性藥物組給予艾迪注射液16.67ml/kg；空白對照組(模型組)給予等容量的生理鹽水。 2實驗結(jié)果2.1療效標準①生存時間各組隨機取大鼠6只，治療后次日起觀察生存天數(shù)，并以生理鹽水組為對照計算生命延長率(％)。生命延長率(％)＝(治療組平均存活天數(shù)/生理鹽水組平均存活天數(shù)-1)×100％。②腫瘤生長率各組余下動物于治療后第8天處死，測量腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按公式V＝ab2/2計算腫瘤體積，根據(jù)治療前后的腫瘤體積比，計算腫瘤生長率](Growth rates，GR)。GR＝治療后的腫瘤體積/治療前的腫瘤體積。③腫瘤壞死程度完整切取以上處死的大鼠瘤塊，置10％福爾馬林液中固定，常規(guī)石蠟包埋，取瘤體最大剖面作2～3處病理切片，HE染色，光鏡下，根據(jù)壞死組織所占整個瘤體的比例分為三度輕度(≤30 9/6)、中度(31 9/5～70％)及重度(71～100％)，比較各組腫瘤壞死程度。統(tǒng)計方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 2.2結(jié)果2.2.1本專利組合物一對大鼠腫瘤壞死程度的影響病理結(jié)果顯示，治療后空白對照組腫瘤壞死程度以中度、重度壞死為主，本專利組合物一組和陽性藥物艾迪注射液組腫瘤壞死程度以輕中度為主，其中本專利組合物一高劑量組腫瘤壞死程度明顯輕于其他各組，也輕于陽性藥物艾迪注射液。 2.2.2本對荷瘤大鼠生存時間的影響治療后各組荷瘤大鼠平均生存時間有顯著差異(P＜0.05)，本專利組合物一各組、陽性藥物艾迪注射液組與生理鹽水組組相比，生存時間明顯延長(P＜0.05)。 三、肺癌1材料與方法1.1材料Lewis肺癌細胞株購于吉林省腫瘤研究所。健康C57BL/6小鼠，雌雄各半，4～6周齡，體重(20±2)g，購于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物室。鹽酸。第VII因子(F8)單克隆抗體、血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)抗體及SP免疫組化試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。 1.2方法1.2.1Lewis肺癌自發(fā)轉(zhuǎn)移模型的建立制備1×10·mL-1Lewis肺癌細胞懸液，以每只0.2mL接種于小鼠左側(cè)后腿皮下組織，制備傳代荷瘤小鼠。在無菌條件下剝?nèi)≡l(fā)瘤組織，以腫瘤(g)生理鹽水(mL)為1∶3的比例制成細胞懸液，以每0.2mI接種于小鼠左側(cè)后腿皮下組織內(nèi)。 1.2.2實驗動物分組及給藥于接種后第2天，將55只小鼠隨機分成4組。對照組(10只)給予等量生理鹽水；小劑量給藥組(15只)給予本專利組合物一8.3mg·kg_。；中劑量給藥組(15只)給予本專利組合物一16.7mg·kg；大劑量給藥組(15只)給予本專利組合物一25mg·kg_。采用i.p給藥方式，每周連續(xù)給藥5d，給藥2周，停藥1周后處死小鼠。 1.2.3繪制腫瘤體積生長曲線待對照組長出原發(fā)瘤后，用游標卡尺隔天測量腫瘤長軸(d。)及與之垂直的寬軸(d2)，按公式V(t)＝0.35[d1(t)×d2(t)]3/2。計算原發(fā)瘤體積，繪制腫瘤體積生長曲線引。 1.2.4計算原發(fā)瘤抑瘤率取各組小鼠原發(fā)瘤稱重，按下列公式分別計算各給藥組小鼠原發(fā)瘤抑瘤率原發(fā)瘤抑瘤率(％)＝(1-給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。 1.2.5檢測腫瘤組織微血管密度(MVD)取部分腫瘤組織，4多聚甲醛固定，F(xiàn)8常規(guī)免疫組織化學(xué)染色。在顯微鏡下計數(shù)20個視野內(nèi)腫瘤微血管數(shù)目，以平均每高倍鏡(×200)視野微血管個數(shù)表示MVD。 1.2.6血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)免疫組化染色及陽性表達結(jié)果的判定VEGF免疫組化染色采用SP法。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知VEGF陽性的乳腺癌作為陽性對照。陽性表達結(jié)果判定采用半定量記分方法，即每張組織切片染色強度陰性為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。陽性細胞比例0％為0分，≤25％為1分，26～50％為2分，＞50％為3分。兩項打分相加≥2分為VEGF染色陽性(+)。 1.2.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。腫瘤體積、腫瘤重量及MVD的組間比較采用t檢驗，VEGF陽性率的組間比較采用卡方檢驗。 2結(jié)果2.1腫瘤體積生長曲線對照組小鼠腫瘤生長曲線陡直，給藥組生長曲線均位于對照組曲線下方，且中、大劑量組比小劑量組小鼠腫瘤生長曲線平緩，中、大劑量組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)。 2.2原發(fā)瘤抑瘤率根據(jù)上述公式計算本專利組合物一大、中、小劑量組小鼠原發(fā)瘤抑瘤率分別為71.04％、49.89％及25.73％。本專利組合物一各劑量組平均原發(fā)瘤重與對照組比較，差異均有顯著性(P＜0.05)。 2.3腫瘤組織微血管密度經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，本專利組合物一中、大劑量組與對照組比較，MVD差異有顯著性(P＜0.05)，小劑量組MVD小于對照組，但差異無顯著性(P＞0.05)。 四、胃癌1材料和方法1.1動物與瘤種 近交系615小鼠，雄性，體重18～22g，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所；小鼠前胃癌FC瘤種，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。 1.2藥品 環(huán)磷酰胺CTX(上海華聯(lián)制藥廠)，RPMI培養(yǎng)基，美國Sigma公司，DMSO，美國GIBO公司。 1.3儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱6100型，日本SANYANG公司；倒置顯微鏡CDS-1型，重慶光學(xué)儀器廠；酶標儀MB3型，北京新技術(shù)應(yīng)用研究所。 1.4實驗方法1.4.1體內(nèi)抑瘤實驗及毒性觀察取小鼠腹腔內(nèi)傳代7d的FC瘤細胞，無菌生理鹽水洗滌2次，計數(shù)后調(diào)瘤細胞到1×106個/mL，于每鼠右腋皮下注射瘤細胞懸液0.2mL，于接種第2天，按性別和體重隨機分為5組①本專利組合物一高劑量組25mg/kg體重(生藥量，下同；相當(dāng)于I臨床人用量的15倍)、②本專利組合物一中劑量組16.7mg/kg體重(相當(dāng)于臨床人用量的10倍)、③本專利組合物一小劑量組8.3mg/kg體重(相當(dāng)于臨床人用量的5倍)，連續(xù)ip本專利組合物一14d，④生理鹽水對照組，⑤以環(huán)磷酰胺、艾迪注射液為陽性對照藥，于第1、第3、第5、第7、第9、第11、第13天ip。于給藥前及給藥后第15天尾靜脈取血計數(shù)白細胞，并計算給藥前后白細胞的變化。同時稱取給藥前及給藥后第15天小鼠體重，計算給藥前后體重的變化。第15天頸椎脫臼處死小鼠，測定瘤重、胸腺和脾臟重量，計算腫瘤生長抑制率(IR)和臟器系數(shù)。 1.4.2體外抑瘤實驗MTY法檢測ZJF對FC瘤細胞增殖的抑制作用。取對數(shù)生長期細胞，制成1.0×109/L懸液，按每孔100uL，接種于96孔培養(yǎng)板(1×104cell.well)培養(yǎng)4h，分別為本專利組合物一組(濃度為100，50，25，16.7，8.3mg/mL的加藥培養(yǎng)基)，空白對照組加100ul培養(yǎng)液，每組設(shè)5復(fù)孔，37℃、5％CO2繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入濃度為5g/L的MTY 20L，于培養(yǎng)箱中孵育4h，吸取上清，每孔加入150ul的DMSO，充分震蕩，酶標儀檢測各孔的光密度吸收值，計算腫瘤細胞生長抑制率。 1.5統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)采用t檢驗。 2結(jié)果2.1本專利組合物一的抗腫瘤作用及對免疫器官指數(shù)的影響與生理鹽水組比較，本專利組合物一各劑量組都有一定的抗腫瘤作用(P＜0.05，P＜0.01)，其中100mg/kg劑量組作用最為明顯(P＜0.01)；本專利組合物一25mg/kg和本專利組合物一16.7mg/kg劑量組ip可明顯降低脾指敷(P＜0.05，P＜0.01)，其中25mg/kg劑量組作用較強(P＜0.01)；本專利組合物一25mg/kg和本專利組合物一16.7mg/kg劑量組、8.3mg/kg可增加胸腺指數(shù)，其中25mg/kg劑量組最為明顯，且優(yōu)于陽性藥物艾迪注射液。表明本專利組合物一體內(nèi)抗腫瘤作用與對免疫功能的影響有密切關(guān)系。本專利組合物一在8.3mg/L濃度范圍內(nèi)作用48h，對FC細胞的增殖有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性，結(jié)果見表1和表2。 2.2本專利組合物一對荷小鼠前胃癌FC小鼠體重及外周血白細胞的影響與給藥前比較，各組體重有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；CTX組體重增加幅度明顯低于生理鹽水組(P＜0.05)；與給藥前比較，本專利組合物一各給藥組外周血白細胞有所增加，給藥前后差值有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；鹽水組和環(huán)磷酰胺、艾迪注射液組外周血白細胞有所降低，給藥前后差值有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，表明本專利組合物一動物的毒副作用小，明顯好于環(huán)磷酰胺和艾迪注射液。上述結(jié)果見表3和表4。 表1 本專利組合物一的抗腫瘤作用及對免疫器官指數(shù)的影響 注與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01表2 本專利組合物一對FC腫瘤細胞的影響 注與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01表3 本專利組合物一對荷小鼠前胃癌FC小鼠體重的影響 注與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01表4 本專利對荷小鼠前胃癌FC小鼠外周血白細胞的影響 具體實施例以下為結(jié)合具體實施方式 對本發(fā)明所作的進一步的詳細描述，并不對本發(fā)明作任何限制實施例1膠囊處方及工藝處方 (按1000粒計)人參 80g靈芝 12g斑蝥 5g干蟾皮3g微粉硅膠 5g制成 1000粒制法取處方量的人參、靈芝、斑蝥、干蟾皮制成提取物。 人參提取物的制備取人參粗粉500g，加5000ml 70％乙醇回流提取三次(第一次浸泡過夜)，每次1小時，合并三次提取液，濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至稠膏每1ml相當(dāng)于原生藥2g的溶液，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5，加乙醇溶液使含醇量達90％，取上清液，減壓回收乙醇，濃縮至相當(dāng)于生藥材1∶1，加水稀釋至1000ml，用10％鹽酸溶液調(diào)pH值7左右，冷藏12小時，濾過，濾液上已處理好的D101大孔吸附樹脂柱(樹脂用量與藥材比為1∶5)，依次用4000ml水和25％乙醇4000ml洗脫，棄去洗脫液，再用70％乙醇溶液4000ml洗脫，收集洗脫液，濾過，回收乙醇，濃縮至每1ml相當(dāng)于原生藥5g的稠膏，于100℃減壓干燥，即得人參提取物，備用。 靈芝提取物的制備取靈芝5kg，超微粉碎，用水50L50℃超聲提取2次，每次20分鐘，合并提取液，過濾，濾液減壓干燥，即得靈芝提取物，備用。 斑蝥提取物的制備稱取斑蝥2kg，加入20L倍量125mmol/L氫氧化鈉溶液，超聲波發(fā)生器中，功率600kHz超聲提取2次(25，15min)。提取液濾過，合并濾液，以3000r/min離心10min，上清液水浴濃縮至20L，減壓干燥即得。 干蟾皮提取物的制備采用溶媒提取法，將蟾酥1kg粉碎成細粉，用90％乙醇滲漉至無色，殘渣繼續(xù)用80％醇滲漉至無色，合并滲漉液。減壓濃縮至浸膏狀。10L水溶解，靜置48小時。取上清液，干燥即得。 取上述提取物加微粉硅膠混均，裝膠囊，即得。 實施例2粉針處方及工藝處方 (按1000瓶計)人參 140g靈芝 50g斑蝥 6g干蟾皮4g甘露醇150g制成 1000瓶制法提取方法同實施例1，但最后的干燥過程應(yīng)在潔凈的環(huán)境中進行。成型工藝為取處方量提取物、甘露醇、60％處方量注射用水溶解；靜置過夜，取上清液。初濾后再用0.2um微孔濾膜精濾；補足注射用水至全量；分裝；凍干；包裝。 實施例3注射液處方及工藝處方 (按1000瓶計)人參 150g靈芝 40g斑蝥 2g干蟾皮0.4g甘露醇150g制成 1000瓶制法提取方法同實施例1，但最后的干燥過程應(yīng)在潔凈的環(huán)境中進行。成型工藝為取處方量提取物、甘露醇、60％處方量注射用水溶解；靜置過夜，取上清液。初濾后再用0.2um微孔濾膜精濾；補足注射用水至全量；分裝；滅菌；包裝。 實施例4片劑處方及工藝處方(按1000片計)人參80g靈芝12g斑蝥5g干蟾皮 3g淀粉50g羥丙基纖維素7g羥甲基淀粉鈉7g微粉硅膠10g制成1000片制法提取方法同實例1。成型工藝為取處方量提取物、淀粉，羧甲基淀粉鈉，用5％羥丙基纖維素作黏合劑，制軟材，20目篩制粒，60℃干燥，加入微粉硅膠整粒，壓片。 實例5滴丸處方及工藝處方(按1000粒計)人參20g靈芝3g斑蝥1g干蟾皮 0.6g聚乙二醇600050g制成1000粒制法提取方法同實例1。成型工藝為取聚乙二醇6000于油浴上加熱至90-100℃，待全部溶解后，加入提取物、攪拌至溶解，轉(zhuǎn)移至貯液瓶中，密閉并保溫再80-90℃，調(diào)節(jié)滴液定量閥門，滴入10-15℃的液體石蠟中，將形成的滴丸瀝干并擦除液體石蠟，干燥。 權(quán)利要求 1.一種治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參1-98.6％、靈芝1-98.6％、斑蝥0.2-98.6％、干蟾皮0.2-98.6％。 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參1-96％、靈芝1-96％、斑蝥1-96％、干蟾皮1-96％。 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參35-92％、靈芝5-30％、斑蝥2-20％、干蟾皮1-15％。 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參55-87％、靈芝10-30％、斑蝥2-10％、干蟾皮1-5％。 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參70％、靈芝25％、斑蝥3％和干蟾皮2％。 6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的配方為人參77.5％、靈芝20％、斑蝥1％和干蟾皮1.5％。 7.一種治療腫瘤的藥物組合物的制備方法，處方組成為人參1-98.6％、靈芝1-98.6％、斑蝥0.2-98.6％、干蟾皮0.2-98.6％。其特征在于各組份使用各組份的提取物。人參提取物的制備取人參粗粉，加乙醇回流提取，濾過，濾液回收乙醇，并濃縮至稠膏，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至堿性，加乙醇溶液，取上清液，減壓回收乙醇，濃縮，加水稀釋，用鹽酸溶液調(diào)pH值至中性，冷藏，濾過，濾液上大孔吸附樹脂柱，用乙醇溶液1洗脫，收集洗脫液，濾過，回收乙醇，濃縮至稠膏，減壓干燥，即得人參提取物，備用。靈芝提取物的制備取靈芝，超微粉碎，用水超聲提取，提取液過濾，濾液減壓干燥，即得靈芝提取物，備用。斑蝥提取物的制備稱取斑蝥，加入氫氧化鈉溶液，超聲提取。提取液濾過，合并濾液，離心，上清液水浴濃縮，減壓干燥即得。干蟾皮提取物的制備采用溶媒提取法，將干蟾皮粉碎成細粉，用乙醇滲漉至無色，滲漉液.減壓濃縮至浸膏狀。水溶解，靜置。取上清液，干燥即得。 8.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤藥物組合物的制備方法，其特征在于所制備的各組份的提取物含有人參多糖，人參皂甙，靈芝多糖，斑蝥素。 9.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤藥物組合物的制備方法，其特征在于所制備的各組份的提取物含有人參多糖，人參皂甙二醇組，靈芝多糖，斑蝥素、華蟾毒精。 10.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤藥物組合物的制備方法，其特征在于所制備的各組份的提取物含有人參多糖，人參皂甙Rg3，靈芝多糖，斑蝥素衍生物、華蟾毒精。 11.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤藥物組合物的制備方法，其特征在于所制備的各組份的提取物含有人參多糖，人參皂甙Rg3，靈芝多糖，靈芝孢子油，斑蝥素衍生物、華蟾毒精。 12.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤藥物組合物(制劑)的制備方法，其特征在于它的劑型是適合臨床應(yīng)用的注射液(包括輸液、凍干粉針)、乳劑、丸劑、滴丸、片劑(包括分散片、口崩片等)、緩釋片、膠囊、軟膠囊、顆粒劑、散劑、錠劑、栓劑、煎膏劑、口服液(合劑)、糖漿劑、軟膏劑、搽劑、涂膜劑等藥劑學(xué)上可以接受的劑型中的任何一種藥物劑型。 全文摘要 本發(fā)明提供了一種能有效的治療腫瘤疾病藥物組合，它由人參、靈芝、斑蝥和干蟾皮組成。它具有清熱解毒、消瘀散結(jié)的功能，適用于原發(fā)性肝癌、肺癌、直腸癌、惡性淋巴癌、婦科惡性腫瘤等疾病的治療，各類腫瘤術(shù)后的鞏固治療，也可以與放、化療配合使用，增效減毒的藥物制劑。 文檔編號A61K35/56GK1907308SQ20051008878 公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月2日 發(fā)明者孫毅 申請人:孫毅 |
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