Introduction

據(jù)估計(jì)，2010年有4800萬(wàn)對(duì)夫婦受到不孕癥的影響，1990年至2010年間不孕癥水平?jīng)]有明顯的改善[1-3]。在美國(guó)，12%的15至44歲的婦女生殖力受損。越來(lái)越多的夫婦依靠輔助生殖技術(shù)(ART)來(lái)懷孕和生育，2015年在美國(guó)共開(kāi)展了231,936個(gè)ART周期[4]。

很大一部分的不育病例是由于遺傳缺陷造成的。男性不育占所有不孕不育病例的50%[5]，已知的遺傳因素占男性不育病例的15-30%[6]。染色體變異[7]、倒位[8]、易位[9]、Y染色體微缺失[10]和基因突變(例如CFTR[11]中的單核苷酸變異(SNVs)是導(dǎo)致男性不育的主要遺傳病因。在女性中，不孕是一種更加異質(zhì)的情況。雖然遺傳學(xué)顯然起著一定的作用，但這些影響大多是多基因的，因此很難確定一個(gè)單一的遺傳病因。最常見(jiàn)的兩種影響女性不孕的因素，排卵功能障礙(25%)和子宮內(nèi)膜異位癥(15%)都具有家族性?xún)A向，表明了遺傳基礎(chǔ)[12]。除此之外，性染色體的改變[13]和一些影響女性生育能力的單基因突變[14，15]，導(dǎo)致了諸如促性腺激素性腺功能低下、卵巢早衰，子宮內(nèi)膜異位癥和多囊卵巢綜合征([12])。

過(guò)去要對(duì)不育癥進(jìn)行明確的基因診斷，需要進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，這就使得這一過(guò)程既昂貴又緩慢。例如，在男性中，需要進(jìn)行多種技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)分析：通過(guò)染色體核型等細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)性染色體非整倍性；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法檢測(cè)Y染色體微缺失；用Sanger 測(cè)序法檢測(cè)CFTR基因突變。然而，對(duì)每個(gè)患者全部方法檢測(cè)一遍是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)槌杀具^(guò)高[16]。而對(duì)女性患者來(lái)說(shuō)，成功率取決于許多因素，年齡是最重要的。不育癥的臨床評(píng)估包括非常多樣化的檢測(cè)，包括血液和尿液激素水平，影像學(xué)，以及對(duì)一些病因不明的患者進(jìn)行的染色體核型或特定基因測(cè)序等遺傳檢測(cè)等。

NGS（Next-generationsequencing）技術(shù)使多個(gè)基因上的變異可以一次性被檢測(cè)到，從而促進(jìn)了基因診斷技術(shù)在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中得到常規(guī)應(yīng)用。在如腫瘤學(xué)[17]和心臟病[18]等領(lǐng)域這已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，基因panel可以對(duì)疾病進(jìn)行更加全面的評(píng)估。NGS也非常具有投入產(chǎn)出比，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)多種生物信息學(xué)算法來(lái)檢測(cè)非常不同類(lèi)型的變異(例如，SNVs、小indels、Y染色體的大段缺失和性染色體非整倍體)。因此，我們介紹了一個(gè)針對(duì)不孕不育遺傳分析的NGS panel和生物信息學(xué)流程。而且我們還對(duì)比了傳統(tǒng)方法和NGS法所會(huì)花費(fèi)的成本。

Results

l 設(shè)計(jì)基因Panel

為了最大化這個(gè)不孕不育遺傳綜合檢測(cè)的臨床效用，我們只關(guān)注被證明對(duì)不育表型有明顯影響的基因。如果該基因的變異在多個(gè)人群中都會(huì)導(dǎo)致不育，且由不同實(shí)驗(yàn)室報(bào)道其與不孕有直接關(guān)系時(shí)，這類(lèi)基因被分類(lèi)為“診斷基因”；當(dāng)該基因的變異被報(bào)道與不育相關(guān)，但因果關(guān)系尚未明確，這類(lèi)基因被歸類(lèi)為“相關(guān)基因”。男性不育panel包括Y染色體微缺失，CFTR突變和性染色體非整倍體[6]。女性不孕panel包括性染色體非整倍體和反復(fù)妊娠失敗相關(guān)的基因變異，包括血栓性疾病、原發(fā)性卵巢功能不全、多囊卵巢綜合征和卵巢過(guò)度刺激綜合征。基因列表以及它們的選擇依據(jù)如Figure 1所示，Figure 2說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)及分析流程。

l  分析和臨床驗(yàn)證

         為了驗(yàn)證panel的性能和測(cè)序分析的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性，我們對(duì)千人基因組(1000G)項(xiàng)目[20]中的24個(gè)樣本進(jìn)行了重新測(cè)序，其中SNVs和 DELs都是已知的。將這些驗(yàn)證樣本的NGS結(jié)果與1000G的已知變異進(jìn)行比較(Table 1)，芯片分析和Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，在千人基因組24個(gè)樣本中，SNVs的靈敏性>99%，對(duì)INDEL>91%，特異性均>99%，SNVS和Indels的準(zhǔn)確性分別為99.98%和99.42%。

為了測(cè)定CNV、性染色體非整倍性和Y染色體微缺失的靈敏性，我們使用了34個(gè)樣本，包含38個(gè)已知變異。這些樣本的已知變異是有限的，因此不能評(píng)估其特異性。分析正確檢測(cè)到3/3 CNVs、19/19性染色體非整倍體和15/16 Y染色體微缺失(Figure 2)。在三例(NA 20435，NA 18333和NA 22031)中，NGS發(fā)現(xiàn)的Y染色體微缺失比之前報(bào)道的缺失??；然而，微陣列分析證實(shí)了先前報(bào)告的微缺失大小。在一個(gè)樣本中(NA 20434)，NGS數(shù)據(jù)位于之前報(bào)道的序列下游1.17Mbp處，微陣列分析證實(shí)了NGS的結(jié)果。樣本NA 12662同時(shí)具有X染色體重復(fù)和Y染色體微缺失((22769319-27097245)X0)；NGS結(jié)果發(fā)現(xiàn)了X染色體重復(fù)，但漏掉了Y染色體微缺失。因此，對(duì)性染色體非整倍性和CNVs的臨床靈敏性為100%(22/22)。 Y染色體微缺失為93.75%(15/16)。

接下來(lái)，分析了攜帶17個(gè)已知SNVs/Indels的11個(gè)DNA樣本(Table 2)，其中16/17得到證實(shí)。樣品NA 02795中報(bào)道了致病性變異GALT C.130G>A；P.Val44Met。然而，該變異未被NGS識(shí)別，Sanger測(cè)序也未檢測(cè)到，因此，基于NGS和Sanger序列的一致性，靈敏性計(jì)算沒(méi)有包含該變異。因此，驗(yàn)證樣本中SNVs/indels的臨床靈敏性為100%。

l CFTR第8內(nèi)含子5T多態(tài)(IVS8-5T)

先天性雙側(cè)輸精管缺失的男性在CFTR基因第8內(nèi)含子的剪接受體位點(diǎn)前發(fā)現(xiàn)不同長(zhǎng)度的堿基T(5，7或9T)[21]。T的長(zhǎng)度與第9外顯子拼接效率有關(guān)。這種多態(tài)性在臨床上是通過(guò)等位基因特異的PCR[22]檢測(cè)到的。為了測(cè)定NGS panel對(duì)該位點(diǎn)的靈敏性，我們對(duì)千人基因組中的72個(gè)樣本重新測(cè)序分析。以1000G數(shù)據(jù)為參考，NGS檢測(cè)到了67/72。對(duì)有差異的5例進(jìn)行Sanger測(cè)序，結(jié)果證明NGS數(shù)據(jù)的結(jié)果是正確的。因此，我們的方法檢測(cè)CFTR IVS8-5T的靈敏性為100%。

l FMR1檢測(cè)

已知CGG三堿基的動(dòng)態(tài)突變會(huì)導(dǎo)致脆性X綜合征，等位基因的前突變與卵巢早衰的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[23]。當(dāng)前NGS技術(shù)基于對(duì)靶序列的雜交富集，因此不能準(zhǔn)確量化重復(fù)序列的數(shù)量。因此，我們使用了已有的PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)CGG重復(fù)序列的方法[24]，作為NGS對(duì)FMR1變異的檢測(cè)的補(bǔ)充。通過(guò)對(duì)26個(gè)含有不同長(zhǎng)度CGG擴(kuò)增樣品的分析，我們準(zhǔn)確的檢測(cè)出了“全突變”（CGG重復(fù)拷貝數(shù)>200），“前突變”（55<CGG重復(fù)拷貝數(shù)<199）和“正常”（CGG重復(fù)拷貝數(shù)<45）的所有樣本。不過(guò)，該方法將“灰區(qū)”(45<CGG重復(fù)拷貝數(shù)<54)的一個(gè)樣本劃分為“前突變”(NA 20236，53 vs 55)。考慮到“灰區(qū)”的擴(kuò)增率尚不清楚，檢測(cè)灰區(qū)個(gè)體的親屬可能會(huì)決定該等位基因的穩(wěn)定性。

l  成本分析

目前，在精液分析后，精液分析結(jié)果嚴(yán)重異常的情況下，會(huì)進(jìn)行多項(xiàng)男性不孕相關(guān)的變異檢測(cè)。舉個(gè)例子，等位基因特異性多重PCR檢測(cè)CFTR IVS8-5T[22]；Y染色體微缺失用序列標(biāo)記位點(diǎn)PCR檢測(cè)[26]；性染色體非整倍體檢測(cè)采用核型或微陣列[27]。NGS可以一次檢測(cè)所有這些變異。為了確定經(jīng)濟(jì)影響，我們進(jìn)行了成本分析。采集進(jìn)行這些分析的參考實(shí)驗(yàn)室的平均價(jià)格(Table 3)。整體而言，多項(xiàng)分析為3322美元，但NGS只需599美元，每例可節(jié)省高達(dá)2723美元，這意味著節(jié)省了550%以上。此外，NGS檢測(cè)的周期更短。唯一例外的可能是染色體重排，嵌合體或倒位/易位的情況，這些情況不會(huì)導(dǎo)致DNA的重復(fù)和缺失，因此不被NGS panel捕獲。

綜上，我想NGS的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)無(wú)需再贅述。除了一些特殊遺傳變異（染色體重排，嵌合體或倒位/易位），對(duì)于已經(jīng)明確的不孕不育的遺傳病因都可以通過(guò)NGS技術(shù)得到準(zhǔn)確的結(jié)果，而且成本低，時(shí)間短。相信隨著不孕不育領(lǐng)域科研的進(jìn)步，對(duì)新基因和疾病機(jī)制的進(jìn)一步了解，NGS的用武之地也會(huì)越來(lái)越大。

作者介紹

田悅  上海尋因生物遺傳分析師，公司主要業(yè)務(wù)包括臨床生物信息學(xué)實(shí)操培訓(xùn)、NGS工作站與生信流程開(kāi)發(fā)（單基因、WES-CNV、NIPT-PLUS、cnv-seq）、遺傳病臨床與科研分析