自去年ASCO驚艷亮相后，近日拉羅替尼（larotrectinib，商品名Vitrakvi，文獻(xiàn)研究也稱LOXO-101）也經(jīng)FDA優(yōu)先審評(píng)后正式上市。這兩天，朋友圈都在熱傳其“廣譜”性（多癌種，17種以上）和高效性（客觀緩解率80%），但鮮有文章關(guān)注其用藥前的精準(zhǔn)檢測(cè)。這里重點(diǎn)摘錄幾篇文獻(xiàn)的檢測(cè)方法及數(shù)據(jù)，結(jié)合我們的分析，提煉出以下關(guān)鍵點(diǎn)，供大家參考。

• 要點(diǎn)1

這是第一款TRK抑制劑（原肌球蛋白受體激酶，tropomyosin receptor kinase）被批準(zhǔn)上市，其靶點(diǎn)是NTRK酪氨酸激酶區(qū)域，屬于TKI小分子藥物。NTRK是編碼TRK的基因，有NTRK1、NTRK2、NTRK3三位家族兄弟，分別位于染色體1q22、9q21、15q25不同區(qū)段，對(duì)應(yīng)編碼的蛋白稱為T(mén)RKA、TRKB和TRKC。酪氨酸激酶區(qū)域都位于NTRK基因的3’端?；锇榛蚺cNTRK基因發(fā)生融合后，TRK融合蛋白將處于持續(xù)活躍狀態(tài)，引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而驅(qū)動(dòng)促進(jìn)TRK融合腫瘤的擴(kuò)散和生長(zhǎng)。

如上圖，larotrectinib結(jié)構(gòu)式

如上圖：NTRK1/2/3表達(dá)的蛋白TrkA/B/C與下游信號(hào)通路形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)

如上圖，NTRK信號(hào)通路研究關(guān)鍵歷史（Nature Reviews, Vol15, 2018）

• 要點(diǎn)2

其“廣譜”性表現(xiàn)為只要NTRK基因與別的伙伴基因發(fā)生融合就是其適用靶標(biāo)，可有效治療17種腫瘤類(lèi)型（2017 ASCO報(bào)道）：肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、胃腸癌、結(jié)腸癌、軟組織肉瘤、唾液腺癌、嬰兒纖維肉瘤、闌尾癌、乳腺癌、膽管癌、胰腺癌。

如上圖，成人和兒童不同腫瘤NTRK陽(yáng)性率

• 要點(diǎn)3

然而，雖然NTRK1/2/3在很多腫瘤中都可發(fā)生融合異常，但其總體陽(yáng)性率實(shí)在太低了，還不夠1%。但在部分少見(jiàn)/罕見(jiàn)癌種中其陽(yáng)性率還是相對(duì)較高的，其中大于25%的癌種（甚至可大于90%）有先天性嬰兒纖維肉瘤、唾液腺（乳腺樣）分泌性癌（MASC）、分泌性乳腺癌；而介于5-25%的癌種為乳頭狀甲狀腺癌、Spitz痣、先天性中胚層腎瘤、乳頭狀甲狀腺癌（放療照射后）、橋腦膠質(zhì)瘤（Pontine glioma）。而發(fā)病率大的腫瘤中其陽(yáng)性率甚至還低于1%（如肺癌、結(jié)直腸癌）。需要注意，larotrectinib做臨床的NTRK陽(yáng)性病例數(shù)也僅有55例（原始數(shù)據(jù)）和67例（補(bǔ)充數(shù)據(jù)）。

如上圖，NTRK各基因在不同癌種中的發(fā)生率

• 要點(diǎn)4

即便目前僅有100多例的陽(yáng)性數(shù)據(jù)，但還是有很多東西可挖掘。這些陽(yáng)性大多數(shù)為不同大小的NGS panel，為經(jīng)過(guò)CLIA認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)出來(lái)的，比如其中有Foundation Medicine、Memorial Sloan Kettering Cancer Center和University ofWashington。55例陽(yáng)性中用NGS檢出43例（78%）。

小部分為用FISH探針檢測(cè)出來(lái)的，且其中為部分用ETV6斷裂探針?biāo)妫▼雰豪w維肉瘤中NTRK3-ETV6融合為特征性分子異常，ETV6有商品化探針，而與之融合的NTRK3卻沒(méi)有）。另外，文獻(xiàn)報(bào)道的NTRK1和NTRK2斷裂探針也多是研究者自己設(shè)計(jì)合成的，很少見(jiàn)有商品化的探針。

臨床試驗(yàn)中也用Pan-TRK免疫組化來(lái)檢測(cè)TRKA、TRKB和TRKC的表達(dá)情況，用的是Abcam公司的兔單抗（克隆號(hào)EPR17341），在Leica Bond III機(jī)器上完成，抗原修復(fù)用的是BOND Epitope Retrieval Solution 2。

如上圖，Loxo Oncology公司在larotrectinib開(kāi)展臨床試驗(yàn)時(shí)的一份附件，用NGS、FISH、RT-PCR三種方法檢測(cè)都可接受，且描述了NTRK與伙伴基因融合的表述匯總

如上圖，Loxo Oncology公司說(shuō)明在嬰兒纖維肉瘤的ETV6-NTRK3檢測(cè)中可用ETV6斷裂探針來(lái)替代

如上圖，一例高分化乳頭狀甲狀腺癌伴甲狀腺外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生ETV6-NTRK3融合，但作者用的是ETV6斷裂探針來(lái)替代檢測(cè)

• 要點(diǎn)5

NTRK與不同伙伴基因融合也有一定的規(guī)律。在2018年8月31日Nature子刊ModernPathology發(fā)表的文獻(xiàn)”Molecular characterization of cancers with NTRK gene fusions”分析了11502例患者，其中31例（占比0.27%）為陽(yáng)性。最常見(jiàn)的融合是ETV6-NTRK3（n=10）和TPM3-NTRK1（n=6）；膠質(zhì)瘤中NTRK融合陽(yáng)性最多（14/982，1.4%），且最常見(jiàn)的為NTRK2（n=6）。而在上述55例原始數(shù)據(jù)中，ETV6-NTRK3融合占28例（51%），TPM3-NTRK1占9例（16%），LMNA-NTRK1融合占5例（9%），IRF2BP2-NTRK1融合占2例（4%），SQSTM1-NTRK1融合占2例（4%），且還有9種不同伙伴基因分別與NTRK1、NTRK2、NTRK3發(fā)生融合，例數(shù)都只有1例。

如上圖，11502例患者中NTRK1/2/3與不同伙伴基因融合的發(fā)生率匯總。需要注意：4073例肺腺癌中總共只有4例NTRK陽(yáng)性，發(fā)生率極為之低

如上圖，NTRK1/2/3與不同伙伴基因融合，對(duì)larotrectinib治療的反應(yīng)也有所差別

• 要點(diǎn)6

由于NGS在美國(guó)開(kāi)展相對(duì)成熟、靈敏度相對(duì)FISH而言更高（可發(fā)現(xiàn)豐度較低的融合基因reads）、且進(jìn)保險(xiǎn)，而FISH探針NTRK1/2/3未有商品化探針、RT-PCR檢測(cè)這么多的融合伙伴基因很難實(shí)現(xiàn)，所以，雖然臨床試驗(yàn)中寫(xiě)了三種方法，但NGS的陽(yáng)性比例占絕大比例（78%，43/55）。需要注意，附件中并沒(méi)看到不同豐度reads的融合對(duì)療效的影響如何。一般而言，NGS檢測(cè)需從FFPE或新鮮樣本中提取幾十ng以上的RNA，用于建庫(kù)及捕獲。

然而，不同大小的NGS panel往往需要設(shè)計(jì)RNA或DNA探針，來(lái)捕獲這三個(gè)基因，特別是較大的NTRK2和NTRK3基因（DNA片段分別長(zhǎng)達(dá)39萬(wàn)和35萬(wàn)堿基對(duì)），外顯子較多，融合類(lèi)型復(fù)雜且分布不一，且只能針對(duì)已知融合位點(diǎn)（序列）設(shè)計(jì)捕獲探針，成本較高，且不同廠家的panel性能可比性還有待積累。這些都是NGS技術(shù)用于NTRK1/2/3融合基因檢測(cè)的缺點(diǎn)。

而Loxo Oncology公司在官方網(wǎng)站上也羅列了10種NGS panel供參考。然而，在我們國(guó)內(nèi)，相關(guān)NGS獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室的panel性能還未見(jiàn)有較權(quán)威的驗(yàn)證數(shù)據(jù)發(fā)表。

如上圖，Loxo Oncology公司推薦的10種NGS panel

• 要點(diǎn)7

針對(duì)NTRK蛋白的IHC檢測(cè)也見(jiàn)有一些文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，但相對(duì)較少。以Abcam公司的pan-Trk兔單抗（克隆號(hào)EPR17341）發(fā)表的數(shù)據(jù)為主，見(jiàn)下圖Nature Modern Pathology文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)及討論。作者的IHC靈敏度為75%（且NTRK3陽(yáng)性病例中45%為IHC假陰性），作者也提及Hechtman等人的靈敏度及特異性分別為95.2%和100%，Rudzinski等人的為97%和98%。不同作者有不同的結(jié)果，是否與所有機(jī)器、抗原修復(fù)方法等也有相關(guān)不得而知。Murphy等人認(rèn)為T(mén)RK IHC有100%陰性預(yù)測(cè)值，但在IHC陽(yáng)性表達(dá)病例中僅有9%為NTRK融合陽(yáng)性。可能pan-Trk可用于NTRK融合基因的初篩，但有一定的漏診率（這篇文獻(xiàn)表現(xiàn)為NTRK1/2約為15%，NTRK3為45%）。當(dāng)然，相對(duì)后續(xù)高昂的用藥費(fèi)用而言，準(zhǔn)確的檢測(cè)/診斷至關(guān)重要，有條件者肯定是需要做FISH或NGS來(lái)確診的。需注意：TRKA/B/C蛋白表達(dá)可見(jiàn)于胞漿、胞膜和胞核等不同位置，且有不同強(qiáng)度。

如上圖，TRKA/B/C蛋白表達(dá)的強(qiáng)度不一，位置多樣

• 要點(diǎn)8

講了這么多，輪到主角出場(chǎng)了：NTRK1/2/3 FISH探針！伙伴基因眾多，是NTRK設(shè)計(jì)為斷裂探針（一頭標(biāo)紅，一頭標(biāo)綠）的天然優(yōu)勢(shì)。且不管是與哪個(gè)基因融合，NTRK都可表現(xiàn)為紅綠分離的陽(yáng)性信號(hào)，且可結(jié)合組織形態(tài)原位觀察、發(fā)現(xiàn)典型陽(yáng)性類(lèi)型之外的其他不典型信號(hào)（往往伴隨復(fù)雜易位或復(fù)雜核型）。在去年ASCO開(kāi)始報(bào)道后，我們就著手開(kāi)發(fā)了出來(lái)NTRK1斷裂探針、NTRK2斷裂探針和NTRK3斷裂探針，且可形成三個(gè)一起檢測(cè)的產(chǎn)品包（需要三張玻片）。產(chǎn)品代碼如下：

F.01103-01NTRK1（1q22-q23.1）基因斷裂探針

F.01289-01NTRK2（9q21）基因斷裂探針

F.01290-01NTRK3（15q25）基因斷裂探針

F.01348-01NTRK1/NTRK2/NTRK3探針

（自我表?yè)P(yáng)5秒鐘~~）

外周血培養(yǎng)中期染色體和樣本檢測(cè)圖如下：

• 要點(diǎn)9

需要注意，NTRK1/2/3斷裂探針的紅、綠端探針位置。NTRK1、NTRK2基因都是從左向右轉(zhuǎn)錄，5’在左邊，3’在右邊。NTRK3基因是從右向左轉(zhuǎn)錄，5’在右邊，3’在左邊。而我們的NTRK1斷裂探針、NTRK2斷裂探針和NTRK3斷裂探針都是左邊標(biāo)記紅色，右邊標(biāo)記綠色。

這是什么意思呢？如上面所述，NTRK基因是靠3’端帶有酪氨酸激酶區(qū)域的片段與伙伴基因發(fā)生融合，融合后導(dǎo)致TRK融合蛋白處于持續(xù)活躍狀態(tài)，引發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而驅(qū)動(dòng)促進(jìn)TRK融合腫瘤的擴(kuò)散和生長(zhǎng)。而酪氨酸激酶區(qū)域所表達(dá)的氨基酸段是larotrectinib的靶向區(qū)域，TRK融合蛋白含有酪氨酸激酶區(qū)域的氨基酸段，用藥才有效，否則無(wú)效。

所以，斷裂探針出現(xiàn)不典型陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，比如1綠1黃、1紅1黃，總之不是典型的1紅1綠1黃信號(hào)，我們就要分析了。NTRK1、NTRK2的3’端（右端）為綠色，出現(xiàn)1綠1黃時(shí)為不典型陽(yáng)性（因?yàn)榭拷?’端的酪氨酸激酶區(qū)域還存在）；而出現(xiàn)1紅1黃時(shí)為陰性（因?yàn)榭拷?’端酪氨酸激酶區(qū)域的綠色區(qū)段缺失了，融合探針不表達(dá)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，藥物無(wú)效）。而NTRK3斷裂探針因?yàn)榧t綠端位置與NTRK1、NTRK2相同，但其5’和3’恰好反過(guò)來(lái)，所以情況與NTRK1/2恰好相反，1紅1黃為不典型陽(yáng)性，1綠1黃為陰性。

當(dāng)然，這是理論上分析的大概率事件，碰到具體樣本時(shí)也有可能恰好對(duì)應(yīng)3’端缺失但酪氨酸激酶區(qū)域還在（雖然概率較低），而用藥有效。

總而言之，碰到這類(lèi)不是典型1紅1綠1黃陽(yáng)性信號(hào)表現(xiàn)為一定的比例（比如大于20%時(shí)），有條件者還是需要結(jié)合NGS分析或核型培養(yǎng)來(lái)相互驗(yàn)證。

這類(lèi)斷裂探針的信號(hào)點(diǎn)大小、紅綠探針間距與ALK、ROS1等斷裂探針類(lèi)似，開(kāi)展時(shí)可參考ALK、ROS1斷裂探針閾值15%，當(dāng)然嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖龇ㄊ欠謩e取陰性樣本來(lái)做閾值建立。

如上圖，NTRK1/2/3可以不同的伙伴基因融合，都涉及到酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域區(qū)段；甚至在與RFWD2、STRN、EML4等基因融合時(shí)還涉及到Transmembrane domain區(qū)段。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

如上圖，NTRK1斷裂探針1紅1黃陽(yáng)性（3’為紅色）。假如此例樣本用我司探針的話則為1綠1黃陽(yáng)性（3’為綠色）（Journal of Thoracic Oncology, 2015）

如上兩圖，判讀標(biāo)準(zhǔn)（3’單紅也算陽(yáng)性），下b圖注意也伴有拷貝數(shù)增加異常。（Nat Med, 2014）

• 要點(diǎn)10

需要注意，2018年的Nature Modern Pathology這篇文獻(xiàn)顯示，有29%的NTRK融合陽(yáng)性病例表現(xiàn)為單一的NTRK融合異常，并不伴有其他細(xì)胞遺傳學(xué)異常。這也提示為什么在部分病例中巨大腫物經(jīng)拉羅替尼治療后可明顯縮小，這就是靶向治療精準(zhǔn)治療啊。

如上圖，全轉(zhuǎn)錄組分析顯示為單一的細(xì)胞遺傳學(xué)融合異常（只有ETV6-NTRK3融合）（Am J Surg Pathol 2016, 40:1051-1061）

• 要點(diǎn)11

由于NTRK1/2/3基因分別位于染色體1q22、9q21、15q25不同區(qū)段，三個(gè)靶標(biāo)的其他信號(hào)異常（如多體、多紅、多綠等）提示其染色體核型或基因組可能比較復(fù)雜，且往往預(yù)后不佳，有條件者需結(jié)合NGS、核型分析進(jìn)一步驗(yàn)證。

如上圖，嬰兒纖維肉瘤，ETV6斷裂探針陰性，核型分析顯示復(fù)雜核型，且伴有EML4-NTRK3融合。（Cold Spring Harb Mol Case Stud, 2015）

如上圖，分泌性乳腺癌，ETV6-NTRK3融合并伴拷貝數(shù)增加。（J Clin Pathol 2009, 62:604-612）

• 要點(diǎn)12

雖然拉羅替尼剛剛被批準(zhǔn)上市，但其耐藥機(jī)制已有研究，涉及到多個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變，這些只能用NGS方法來(lái)檢測(cè)了。

如上圖，TRKA/B/C蛋白的部分熱點(diǎn)突變。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

• 要點(diǎn)13

需要注意，國(guó)內(nèi)已獲批準(zhǔn)的克唑替尼（Crizotinib）的靶點(diǎn)不但是針對(duì)ALK、ROS1和MET，也可針對(duì)NTRK融合基因，其也是一種TRK抑制劑，只是與TRK的結(jié)合活性明顯比ALK、ROS1和MET低。（Nature Reviews, Vol15, 2018）

另外，Cabozantinib也可靶向MET、RET、AXL、TRKA和TRKB。Ponatinib最早是作為BCR-ABL1抑制劑，后來(lái)發(fā)現(xiàn)也可靶向NTRK融合蛋白；Nintedanib是抗血管生成藥物（VEGFR TKI），但也可抑制PDGFR、FGFR和TRK激酶。

• 要點(diǎn)14

Larotrectinib和Entrectinib為第一代TRK抑制劑已有臨床研究及剛被批準(zhǔn)上市，第二代的TRK抑制劑如LOXO-195、TPX-0005、ONO-5390556等藥物在體外研究中也顯示出良好的針對(duì)TRK耐藥突變位點(diǎn)的活性，并且在較低的藥物濃度范圍下就可其作用。Larotrectinib耐藥后，未來(lái)的TRK抑制劑也更值得期待。

部分引用文獻(xiàn)：

1: Gatalica Z et al. Molecular characterization of cancers with NTRK gene fusions. 2018, Modern Pathology.

2: Laetsch TW et al. Larotrectinib for paediatric solid tumours harbouring NTRK gene fusions: phase 1 results from a multicentre, open-label, phase 1/2 study. www.thelancet.com/oncology Vol 19 May 2018.

3: Drilon A et al. Efficacy of Larotrectinib in TRKFusion-Positive Cancers in Adults and Children.2018, N Engl J Med, February 22.

4: Cocco E et al. NTRKfusion- positive cancers and TRK inhibitor therapy. 2018, Nature Reviews Clinical Oncology, Vol 15.