動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病和患者死亡的主要原因，迄今仍未闡明其確切的病因及發(fā)病機(jī)制^[1]。其主要治療藥物是調(diào)脂、抗凝及溶栓藥物，治療效果也不夠理想^[2]。中醫(yī)無“動(dòng)脈粥樣硬化”的病名，但可歸為“胸痹”

1  材料與方法

1.1  數(shù)據(jù)庫

1.2  方法

1.2.1  化學(xué)成分和疾病的候選靶點(diǎn)預(yù)測  在TCM-IP平臺(tái)中藥材數(shù)據(jù)庫中對心可舒片組方中藥丹參、葛根、三七、山楂和木香進(jìn)行化學(xué)成分信息收集，包括CAS號(hào)、中文名稱、英文名稱、分子式、相對分子質(zhì)量、藥理作用，并建立心可舒片的化學(xué)成分信息數(shù)據(jù)庫。利用TCM-IP平臺(tái)開源軟件OpenBabel提取心可舒片化學(xué)成分MACCS分子指紋，通過化學(xué)成分二維結(jié)構(gòu)（.mol）與FDA上市藥物進(jìn)行化學(xué)指紋特征比對，以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法進(jìn)行相似性打分，取打分系數(shù)＞0.8所得的藥物靶點(diǎn)為此次研究所需要的作用的潛在靶點(diǎn)，建立心可舒片候選靶點(diǎn)信息數(shù)據(jù)庫。在疾病/癥狀靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，以“atherosclerosis”作為疾病或癥狀關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，提取心可舒片中干預(yù)AS的藥物名稱、藥物療效、藥物靶點(diǎn)的基因和蛋白質(zhì)相關(guān)信息，作為候選靶點(diǎn)來源。

靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。通過TCM-IP平臺(tái)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）數(shù)據(jù)庫，獲得心可舒片作用的潛在靶點(diǎn)與“atherosclerosis”疾病靶點(diǎn)之間的PPI信息并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，以“節(jié)點(diǎn)連接度（degree）≥2倍中位數(shù)”為篩選條件，選取心可舒片靶點(diǎn)-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)（hubs）；接著，以“degree≥中位數(shù)”“緊密度（closeness）和介度（betweenness）均大于等于其中位數(shù)”為條件^[11]，選取心可舒片干預(yù)AS的候選靶點(diǎn)；然后，通過對上述候選靶點(diǎn)所參與的功能和通路進(jìn)行分析，并構(gòu)建“復(fù)方-中藥-成分-靶點(diǎn)-通路”的多層次網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)圖。

1.2.3

2  結(jié)果

2.1  心可舒片所含成分及其預(yù)測靶點(diǎn)信息

絡(luò)中degree值最高的中藥是山楂，degree值排在前10位的成分是棕櫚酸、亞油酸、蔗糖、熊果酸、琥珀酸、花生酸、庚酸、壬酸、二十一碳酸和烏藥酸，見圖1。

2.2  心可舒片預(yù)測靶點(diǎn)生物信息學(xué)分析

2.3  心可舒片干預(yù)AS候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過TCM-IP平臺(tái)的PPI相互作用數(shù)據(jù)庫，建立心可舒片藥物靶點(diǎn)與AS靶點(diǎn)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)條件篩選出核心靶點(diǎn)461個(gè)，其中紅色代表潛在藥物靶點(diǎn)（putative drug target），灰色代表其他。根據(jù)degree排序僅顯示排名前100的靶點(diǎn)得到心可舒片干預(yù)AS的候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖3。節(jié)點(diǎn)的大小與degree呈正比關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的degree值越大，說明這個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。其中，degree值排在前10位的基因分別是B4GALT4、B4GALT2、PRKCD、GCK、GNB1、ADCY2、CASK、ADCY5、PRKAA2、SSTR1。其中網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的節(jié)點(diǎn)為B4GALT4基因，表明B4GALT4相對應(yīng)的蛋白在心可舒片干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。對前10位的基因進(jìn)行Pathway的通路分析，選取Pathway的P≤0.05為有意義的通路。結(jié)果顯示與鈣調(diào)蛋白、G蛋白、γ-氨基丁酸通路密切相關(guān)，見圖4。

2.4  心可舒片干預(yù)AS關(guān)鍵靶點(diǎn)生物信息學(xué)分析及“成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建

對候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，P值排名前20的候選靶點(diǎn)功能信息主要涉及MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、免疫過程、氨基酸代謝等多個(gè)生物學(xué)過程；胞外體、線粒體、髓鞘等多個(gè)細(xì)胞組分蛋白激酶結(jié)合、ATP結(jié)合和藥物應(yīng)答等多個(gè)分子功能（圖5-A）；對候選靶點(diǎn)進(jìn)行Pathway富集分析，P值排名前20的候選靶點(diǎn)通路信息主要涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)中甲狀腺激素、雌激素，神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)傳導(dǎo)、谷氨酸能突觸，免疫系統(tǒng)中趨化因子，循環(huán)系統(tǒng)和細(xì)胞生長和死亡等通路（圖5-B）。通過上述分析，借助TCM-IP平臺(tái)建立心可舒片干預(yù)AS“成分-靶點(diǎn)-通路”多維網(wǎng)絡(luò)，見圖6。心可舒片干預(yù)AS的成分共80個(gè)，丹參中15個(gè)、三七中37個(gè)、山楂中19個(gè)、葛根中7個(gè)、木香中9個(gè)。研究表明，丹酚酸B可通過抗氧化、抗炎和抑制TLR₄-NF-κB-TNF-α通道，而影響AS^[13]；三七總皂苷、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rb₁、三七皂苷R₁均有抗AS作用^[14-16]；槲皮素可激活PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路，起到抗AS作用^[17]；棕櫚酸能夠升高血漿游離脂肪酸水平，熊果酸可能通過調(diào)節(jié)血脂，抑制炎癥反應(yīng)以及降低氧化應(yīng)激損傷而對AS大鼠表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用^[21]；染料木黃酮可以結(jié)合雌激素受體進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核因子-κB（NF-κB）活性及炎性細(xì)胞因子分泌，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，抑制AS的形成^[22]。

2.5  心可舒片干預(yù)AS網(wǎng)絡(luò)機(jī)制探討

對“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)中取P值排名前5的通路內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）、甲狀腺激素信號(hào)通路（thyroid hormone signalingpathway）、神經(jīng)系統(tǒng)（nervous system）、雌激素受體信號(hào)傳導(dǎo)通路（estrogen signaling pathway）和趨化因子信號(hào)通路（chemokine signaling pathway）中富集的基因進(jìn)行韋恩分析，見圖7。其中，5條通路的共有基因13個(gè)：HRAS、RAF1、PLCB2、MAPK3、PLCB3、KRAS、AKT1、PIK3R1、AKT3、PRKACA、PIK3CG、MAP2K1、SRC。將這13個(gè)基因帶入KEGG Mapper，分析得到共有機(jī)制，結(jié)果顯示心可舒片干預(yù)AS的機(jī)制與干預(yù)PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑密切相關(guān)，見圖8。

3  討論

AS是危害人類健康的主要疾病之一，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療方法的不斷發(fā)展，其病死率呈現(xiàn)下降趨勢，但死亡總數(shù)仍在不斷增加^[23]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為“損傷反應(yīng)學(xué)說”是AS發(fā)病的主要機(jī)制。其發(fā)病機(jī)制的主要過程首先是內(nèi)皮損傷，其次是脂質(zhì)積聚^[3]，而粥樣斑塊的形成是動(dòng)脈對內(nèi)皮損傷反應(yīng)的結(jié)果。AS屬于中醫(yī)“胸痹”“脈痹”“真心痛”等病癥范疇，氣滯血瘀證是其主要證候之一^[3]。心可舒片由丹參、葛根、三七、山楂、木香5味藥物組成，具

有活血化瘀、行氣止痛的功效。2017年發(fā)布的《動(dòng)脈粥樣硬化中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》中明確了心丹參、山楂和丹參、葛根藥對于大鼠AS的發(fā)生發(fā)展具有良好的干預(yù)作用，作用與調(diào)節(jié)血脂水平、強(qiáng)抗氧化作用以及增強(qiáng)內(nèi)皮功能有關(guān)^[25]；臣藥葛根中黃酮類有效成分降低了AS病變內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制AS斑塊的進(jìn)展^[26]。但國內(nèi)外對心可舒干預(yù)AS的研究尚不足。因此，探究心可舒片用于AS的藥效和機(jī)制研究對于心可舒片的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用具有十分重要意義。

和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）等多個(gè)靶點(diǎn)。Akt磷酸化后可以促進(jìn)eNOS活化，使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO增多，NO具有抑制血小板聚/ eNOS途徑在AS的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，抑制該途徑，可延緩AS的形成及進(jìn)展。研究表明，其中丹酚酸B可通過PI3K-Akt信號(hào)通路干預(yù)大鼠心肌缺血再灌注損傷^[34]；人參皂苷Rg₁通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路調(diào)控異丙腎上腺素致急性心肌缺血大鼠心肌的抗氧化作用^[35]，但對于AS中信號(hào)通路的影響尚未見報(bào)道。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs可將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)及核內(nèi)，而引起細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及調(diào)亡等各種生物學(xué)反應(yīng)^[36]。ERK是MAPKs中的重要成員之一，可被炎性刺激激活，通過相應(yīng)的下游信號(hào)分子調(diào)節(jié)多種內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、分化和增殖。Raf以級(jí)聯(lián)反應(yīng)的方式調(diào)節(jié)相關(guān)靶蛋白，形成經(jīng)典Raf/MEK/ERK途徑。Raf/MEK/ERK途徑可由活性氧（ROS）、Ca²⁺、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等激活，并參與體內(nèi)多種生理生化功能，對細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡均有影響^[37]。Raf/MEK/ERK途徑目前在腫瘤治療、神經(jīng)保護(hù)方面研究較多，對抑制Raf/MEK/ERK途徑來抑制腫瘤的發(fā)展己經(jīng)成為腫瘤開發(fā)藥物的新方向，但鮮有其在AS方面的研究。

PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑廣泛存在于體內(nèi)各種細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種功能中起重要作用^[38]。本研究結(jié)果首次提示心可舒片通過對PI3K/Akt/eNOS和Raf/MEK/ERK途徑的共同調(diào)節(jié)，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而達(dá)到干預(yù)AS的效果，對于心可舒片的開發(fā)和應(yīng)用具有十分重要意義。心可舒片干預(yù)AS的藥效作用網(wǎng)絡(luò)、方劑配伍關(guān)系仍需在病證背景下做進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：李曉宇，徐  男，黃娜娜，吳成勝，劉閏平，郭文鶴，李曉驕陽，孫  蓉. 整合藥理學(xué)方法的心可舒片干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化作用網(wǎng)絡(luò)機(jī)制探討 [J]. 中草藥, 2018, 49(15):3463-3470.