自噬的發(fā)生過程以大自噬為例，可人為分為4 個(gè)階段(圖1) [11 ] ①分隔膜的形成。在饑餓、某些激素等因素刺激下, 有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成。②自噬體的形成。隨著分隔膜逐漸延伸, 將要被降解的胞漿成分完全包繞隔離開形成自噬體。③自噬體的運(yùn)輸、融合。自噬體形成后將其包裹物運(yùn)輸至溶酶體內(nèi)與溶酶體融合形成自噬溶酶體, 這一過程并非簡(jiǎn)單的擴(kuò)散, 而是通過細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的傳輸實(shí)現(xiàn)的[9，10 ] 。④自噬體的裂解。自噬體融合后最終被溶酶體中的水解酶溶解, 它首先經(jīng)過囊泡酸化, 達(dá)到所需pH 值后，經(jīng)多種蛋白酶作用使囊內(nèi)容物降解，降解產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)利用[11]。

　　圖1 　自噬的形成過程簡(jiǎn)圖[11]

　　在哺乳動(dòng)物自噬的自噬泡形成過程中，由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12 和LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)參與組成的兩條泛素樣蛋白加工修飾過程：Atg12-結(jié)合過程和LC3修飾過程起著至關(guān)重要的作用[12]。Atg12-結(jié)合過程與前自噬泡(Preautophagosome)的形成相關(guān)，而LC3修飾過程對(duì)自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。泛素是在真核生物中普遍存在，具有很高的保守性的一種蛋白質(zhì)。泛素化是細(xì)胞維持對(duì)那些受組成型調(diào)節(jié)和環(huán)境刺激產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水平的基本調(diào)節(jié)方式。泛素-蛋白酶體途徑是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程：細(xì)胞增生與分化，以及信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞生理過程，因此細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化降解是蛋白質(zhì)重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一。泛素化底物及其隨后的降解過程貫穿于整個(gè)細(xì)胞的質(zhì)膜系統(tǒng)，從細(xì)胞膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到核膜等。泛素化系統(tǒng)的作用位點(diǎn)主要位于細(xì)胞膜表面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核。細(xì)胞泛素化與去泛素化過程的改變與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。認(rèn)識(shí)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)泛素化降解過程，對(duì)治療由泛素系統(tǒng)紊亂而引起的各種疾病，尤其是惡性腫瘤具有重要意義[13]。

　　目前發(fā)現(xiàn)參與泛素化反應(yīng)的酶至少有E1，E2，E3 這三類：E1 即泛素活化酶(activating enzyme， Ub) ，在ATP(三磷酸腺苷)的參與下，E1 以其活性位點(diǎn)半胱氨酸的巰基與泛素的C 末端生成高能硫酯鍵，使泛素活化;E2 即泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzymes ，Ubs) ，是多個(gè)成員組成的蛋白家族，可接受E1傳遞來Ub , 在E3 的參與下將Ub 轉(zhuǎn)移到底物上;即泛素2蛋白質(zhì)連接酶(Ub-protein ligase) ，它分為兩類，含HECT 結(jié)構(gòu)域的E3 和含環(huán)酯結(jié)構(gòu)域的E3 。泛素2蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway ,UPP) 不僅是一種破壞陳舊或損壞蛋白質(zhì)的重要機(jī)制之一，而且還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、受體胞吞、抗原呈遞、細(xì)胞增生與分化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種細(xì)胞生理過程。UPP 水解底物的主要步驟為：識(shí)別被降解的靶蛋白;多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合到蛋白質(zhì)底物上，形成多聚泛素鏈;通過26S 蛋白酶體復(fù)合物降解靶蛋白，同時(shí)釋放游離的、可重新利用的泛素分子。 E3即泛素連接酶，近來又發(fā)現(xiàn)一類含U2box 結(jié)構(gòu)域的E3。它們直接或間接與底物結(jié)合，促進(jìn)Ub從與E2 的硫酯鍵中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到底物上，或轉(zhuǎn)移到已與底物相連的泛素形成泛素鏈，作為底物降解的靶向性信號(hào)[13]。

　　在細(xì)胞自噬過程中，Atg12首先由E1泛素活化酶 (Ub)Atg7活化，之后轉(zhuǎn)運(yùn)至E2泛素結(jié)合酶(Ubs)Atg10，最后與Atg5結(jié)合，形成自噬體前體(Autophagosomal precursor)。LC3前體(ProLC3)形成后，首先加工成胞漿可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸殘基。同樣，LC3-I也被Atg7活化，轉(zhuǎn)運(yùn)至第二種E2泛素結(jié)合酶Atg3，并被修飾成膜結(jié)合形式LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體，使之成為自噬體的標(biāo)志分子。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3-II即被溶酶體中的水解酶降解。LC3是酵母自噬相關(guān)基因ATG8的類似物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性Atg5和Atg12主要以結(jié)合形式存在;而胞漿可溶性LC3-I和膜結(jié)合型LC3-II的比例在不同組織和細(xì)胞類型變化很大。哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過程中兩條泛素樣加工修飾過程可以互相調(diào)節(jié)，互相影響。Atg5 基因缺陷的鼠胚胎干細(xì)胞缺乏Atg12-Atg5復(fù)合物，其LC3-I到LC3-II的修飾同時(shí)受到影響 [14]。

　　實(shí)驗(yàn)證明，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293中，Atg3除作用于其底物L(fēng)C3, GATE-16 (Golgi-associated ATPase enhancer of 16 kDa，分子量為16kDa的高爾基體相關(guān)ATP酶增強(qiáng)子) 和GABARAP(γ-amminobutyric acid receptor associated protein，γ-氨基丁酸受體相關(guān)蛋白)外，還與Atg12和Atg12-Atg5復(fù)合物相互作用 [15,16]。雖然HEK293細(xì)胞中單獨(dú)超表達(dá)游離的Atg12促進(jìn)了LC3-I到LC3-II的修飾，過多Atg12-Atg5復(fù)合物的存在卻可抑制上述修飾過程 [15]。在Atg7存在的情況下，HEK293細(xì)胞超表達(dá)哺乳動(dòng)物Atg3可促進(jìn)Atg12-Atg5復(fù)合物的形成[16]。這些研究結(jié)果提示：Atg3與Atg12和Atg12-Atg5復(fù)合物的相互作用在Atg12結(jié)合和LC3修飾兩條泛素化修飾過程中起重要作用。哺乳動(dòng)物Atg10除結(jié)合Atg12外，還與LC3相互作用[17]。Atg10與Atg12形成E2樣底物中間物，但不與LC3結(jié)合。在Atg7存在下，超表達(dá)Atg10還可促進(jìn)LC3-I到LC3-II的修飾[17]。酵母和哺乳動(dòng)物的Atg7以同源二聚體形式存在[ 18,19]。

　　最初認(rèn)為自噬與凋亡兩種程序性細(xì)胞死亡方式在形態(tài)、生化指標(biāo)、參與分子和機(jī)理方面均存在不同，近年研究提示，二者在某些情況下可以相互拮抗或促進(jìn)，可先后發(fā)生或同時(shí)共存于同一細(xì)胞，相同誘導(dǎo)因素在不同細(xì)胞中可分別誘發(fā)自噬或凋亡;參與自噬和凋亡的分子也可能存在交叉，這些分子在自噬與凋亡兩種程序性細(xì)胞死亡中可發(fā)揮正向或負(fù)向作用。研究的深入，自噬與凋亡之間的相互關(guān)系似乎變得越來越復(fù)雜了。有報(bào)道稱Beclin 1可通過增強(qiáng)Caspase-9的活性加強(qiáng)化療藥物CDDP誘導(dǎo)的人胃癌細(xì)胞MKN28的凋亡，說明作為自噬重要調(diào)控基因的Beclin 1也可參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[20]。營養(yǎng)剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬在Atg基因(Atg5, Atg6/Beclin 1, Atg10, Atg12)干擾RNA或自噬特異抑制劑劑(如3-MA)存在的情況下，細(xì)胞發(fā)生凋亡[21]。 廣譜Caspase抑制劑zVAD 通過抑制Caspase-8活性，發(fā)揮誘導(dǎo)自噬性死亡作用，并且這種細(xì)胞死亡需要ATG7和Beclin 1基因參與[22]。

　　應(yīng)用RNA干擾或同源重組技術(shù)將LAMP-2基因敲除，細(xì)胞在營養(yǎng)剝奪情況下，首先發(fā)生自噬，繼而發(fā)生凋亡，同時(shí)伴隨凋亡的典型特點(diǎn)，如線粒體跨膜電位的喪失、Caspase的活化和染色質(zhì)的凝集[23]。 另研究證明LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加，幸存的小鼠出現(xiàn)多組織廣泛的胞漿空泡[24]。凋亡刺激信號(hào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)去除或?qū)奏ぐ⒗擒占尤牒琋GF的交感神經(jīng)的神經(jīng)元，細(xì)胞在出現(xiàn)以DNA片斷化為主的凋亡特點(diǎn)前，首先出現(xiàn)大量的自噬泡[25]。說明細(xì)胞凋亡與自噬互相交叉。

　　Pyo JO 等人的研究發(fā)現(xiàn)由IFN-γ或Atg5超表達(dá)誘導(dǎo)的Hela(人子宮頸癌傳代細(xì)胞)細(xì)胞死亡之前，首先發(fā)生以大量胞漿空泡出現(xiàn)為主的自噬的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。由IFN-γ誘導(dǎo)的胞漿空泡的出現(xiàn)和細(xì)胞死亡可被3-MA或Atg5K130R超表達(dá)所抑制，而廣譜胱天蛋白酶抑制劑zVAD-fmk只能抑制細(xì)胞死亡，卻不能抑制胞漿空泡的出現(xiàn)。這說明以胞漿空泡出現(xiàn)為主的自噬可繼發(fā)Caspase依賴的細(xì)胞死亡。進(jìn)一步的研究證明Atg5通過和FADD (Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD) 的相互作用發(fā)揮促進(jìn)自噬細(xì)胞死亡的作用, 而FADD是細(xì)胞膜受體Fas/FasL途徑凋亡的重要參與分子[26]。另外，Bcl-2家族蛋白不僅參與凋亡形式的細(xì)胞死亡，還參與了對(duì)自噬形式細(xì)胞死亡的調(diào)控[27，28]。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配基(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)在人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A組織形成過程中，誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡以形成中空的腔狀結(jié)構(gòu)，此過程同時(shí)伴隨發(fā)生Caspase依賴的細(xì)胞凋亡事件[29]。

待續(xù)......