慢病毒載體（LV）提供了許多有價(jià)值的特性，包括穩(wěn)定的將基因整合到宿主基因組中，通過VSV-G假型分型將遺傳信息轉(zhuǎn)移到分裂和非分裂細(xì)胞以及廣泛的組織趨向性能力。目前正在臨床試驗(yàn)中用于治療罕見和更頻密的遺傳和后天疾病，以及CAR-T細(xì)胞癌癥治療。

慢病毒載體通常是通過多質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK 293貼壁細(xì)胞株而產(chǎn)生，此細(xì)胞株通常培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)液中。然而這種方法是實(shí)驗(yàn)室密集型，需依賴質(zhì)粒的供應(yīng)，不能直接放大。貼壁培養(yǎng)需通過增加細(xì)胞附著和生長的可用面積來放大。由于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中過量的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的殘留，會引起終產(chǎn)物的污染。因此，穩(wěn)定的慢病毒載體生產(chǎn)細(xì)胞株運(yùn)行而生。目前已成功的構(gòu)建方法是通過誘導(dǎo)系統(tǒng)來避免細(xì)胞毒素蛋白（Gag，Rev和VSV-G）的持續(xù)表達(dá)而引起的細(xì)胞凋亡。用于穩(wěn)定生產(chǎn)的貼壁細(xì)胞株已被廣泛報(bào)道，但卻限制了放大和大規(guī)模生產(chǎn)。通過高度強(qiáng)化的貼壁培養(yǎng)物，及一次性固定床生物反應(yīng)器，已解決部分病毒放大培養(yǎng)。與此同時(shí)，一些學(xué)術(shù)和工業(yè)實(shí)驗(yàn)室正在開發(fā)懸浮培養(yǎng)工藝，最終可實(shí)現(xiàn)在傳統(tǒng)的攪拌罐中完成慢病毒載體的生產(chǎn)。

根據(jù)近期文獻(xiàn)報(bào)道，該領(lǐng)域正在向應(yīng)用懸浮工藝生產(chǎn)慢病毒載體的方向發(fā)展。事實(shí)上，在治療中應(yīng)用的慢病毒載體，需要以可再生的方式生產(chǎn)足夠數(shù)量的臨床和商業(yè)品質(zhì)的病毒。根據(jù)應(yīng)用和疾病，每名患者需要1-40 × 10 ⁹個(gè)感染單位的載體; 不僅增加了經(jīng)濟(jì)壓力，還需要開發(fā)高產(chǎn)量的生產(chǎn)工藝。

在本研究中，我們提出了一種生產(chǎn)慢病毒載體的方案，它使用的是一種穩(wěn)定的可誘導(dǎo)的生產(chǎn)細(xì)胞系，并且該細(xì)胞系為我們之前描述的并且在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長的包裝細(xì)胞系。在添加cumate和多西環(huán)素后，可誘導(dǎo)包裝慢病毒載體所必需組件的基因表達(dá)。由于慢病毒載體的穩(wěn)定性差，我們開發(fā)了一種在灌流模式下的生產(chǎn)工藝，并評估了兩種方案的差異。

本研究所述的實(shí)驗(yàn)中，HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92細(xì)胞系（簡稱clone 92）生長和維持在SFM4TransFx293 (Hyclone)或者iHyCell? TransFx-H media (Hyclone)培養(yǎng)液中，并且兩種培養(yǎng)液均添加4mM L-谷氨酰胺。泊洛沙姆188是一種適用于高剪切力環(huán)境中的保護(hù)劑，并且在HyCell? TransFx-H培養(yǎng)液中添加0.1%泊洛沙姆188。Cell Boost 5?（CB5）補(bǔ)充劑（3.5 g / L）（Hyclone）是一種化學(xué)成分的增強(qiáng)劑，只有在文中注明的情況下才補(bǔ)充。使用軌道搖床(InforsHT)，設(shè)置110-120 rpm，37℃，5%CO₂條件下于搖瓶中懸浮培養(yǎng)。通過自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器（Cedex Automated Cell Counter或Nucleocounter?nc-200?）或血球計(jì)數(shù)板和赤蘚紅B進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10 ⁶個(gè)/ mL時(shí)，進(jìn)行規(guī)律傳代。

根據(jù)制造商建議，使用maxiprep試劑盒(Chiagen)純化質(zhì)粒。先前已經(jīng)闡述通過一步法獲得構(gòu)建HEK293SF-LVP-CMVGFPq-92所使用的包裝細(xì)胞系（即，所有LV組分在一次轉(zhuǎn)染中同時(shí)加入）¹⁴。為了構(gòu)建clone 92，使用Lipofectamine 2000試劑（Life Technologies）與經(jīng)StuI 線性化的pCSII-CMV5-GFP質(zhì)粒和經(jīng)Xho1線性化的編碼殺稻瘟菌素的抗性的pCDNA6-hisA (Life Technologies) 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染在補(bǔ)充有1％FBS（Hyclone）的LC-SFM培養(yǎng)液（Life Technologies）中培養(yǎng)的包裝細(xì)胞系（clone 29-6），上述兩種質(zhì)粒質(zhì)量比（μg/μg）為7：1。轉(zhuǎn)染兩天后，向培養(yǎng)液中加入7μg/ mL殺稻瘟菌素（InvivoGen），直至產(chǎn)生具有抗殺稻瘟菌素細(xì)胞庫（約三周）。然后使用不含有殺稻瘟菌素的培養(yǎng)液在96孔板中有限稀釋，并進(jìn)行亞克隆。篩選克隆細(xì)胞并首次分析GFP的表達(dá)。將具有高水平GFP表達(dá)的克隆株擴(kuò)增并通過加入1μg/ mL多西環(huán)素和30μg/ mL的cumate誘導(dǎo)細(xì)胞觀測慢病毒的產(chǎn)生。從最穩(wěn)定的生產(chǎn)克隆株中選取一株（clone 92），并在補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺的SFM4Transfx-293無血清培養(yǎng)基（Hyclone）中適應(yīng)性培養(yǎng)。研究細(xì)胞庫在補(bǔ)充有10％DMSO（Sigma）的相同培養(yǎng)基中制備。

將clone 92在SFM4TransFx-293中解凍，并接種在含有20mL培養(yǎng)液的125mL搖瓶中。在解凍后2、6、10周時(shí)，在1×10⁶個(gè)/mL細(xì)胞密度下誘導(dǎo)產(chǎn)生慢病毒載體。在48后，經(jīng)離心澄清，收集含有慢病毒載體的上清液，并添加1%胎牛血清（保護(hù)劑），然后凍存在-80℃。采用基因轉(zhuǎn)移法測定上清液中慢病毒載體滴度（2.6節(jié)）。

在第一組搖瓶實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞按0.2 x 10⁶個(gè)/mL接種在SFM4TransFx293培養(yǎng)液中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.5 x 10⁶個(gè)/mL時(shí)，按照每瓶50mL分裝于250mL搖瓶中。誘導(dǎo)前，需每天更換培養(yǎng)液，即細(xì)胞經(jīng)離心（300g，5mins）后，更換不同比例（1-100%）的新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，且連續(xù)換液5天。為了減少細(xì)胞聚集，細(xì)胞經(jīng)Accumax TM（Sigma）處理30分鐘后，用Cedex自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)及活力的測定。

在第二組實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞按0.3×10⁶個(gè)/mL密度分批次接種于500mL搖瓶中，培養(yǎng)液為100mL含有有3.5g/L CB5的HyCell? TransFx-H完全培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)≥5E6 個(gè)/mL時(shí)，將細(xì)胞懸液按每瓶20mL分裝于125mL搖瓶中，并添加1μg/mL多西環(huán)素和30μg/ mL的cumate進(jìn)行誘導(dǎo)。從誘導(dǎo)后24小時(shí)開始，每隔24小時(shí)，分別使用含有3.5 g/L CB5和不含CB5的的培養(yǎng)液進(jìn)行50％換液。收集液經(jīng)0.45μm過濾后，使用GTA測定病毒載體滴度。使用NucleoCounter?NC-200?記錄每日細(xì)胞總數(shù)和活力。

使用生物反應(yīng)器進(jìn)行4次分批實(shí)驗(yàn)，同時(shí)灌流實(shí)驗(yàn)1#與先前實(shí)驗(yàn)條件相同；并且已經(jīng)詳細(xì)描述過相似情況。即使用Chemap 3.5L型SG生物反應(yīng)器容器（工作體積2.7L）并配備探針以測量和控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)（溫度37℃，pH 7.05-7.1，溶解氧（DO）40％，攪拌80rpm）。在灌流模式中，通過反吹模式的10L超聲濾器（AppliSens，Schiedam，Netherlands）將細(xì)胞保留在生物反應(yīng)器中（每次反沖洗時(shí)將細(xì)胞懸浮液完全循環(huán)到生物反應(yīng)器中），時(shí)間間隔為30分鐘，運(yùn)行/停止比例為55/5秒（圖4）。培養(yǎng)物以分批模式培養(yǎng)至約1-1.5×10⁶個(gè)/ mL。灌流模式以每天0.5反應(yīng)體積實(shí)施灌流（VVD），并在誘導(dǎo)后增加至1VVD。當(dāng)灌流模式中到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞密度（5×10⁶個(gè)/mL）后進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

在灌流實(shí)驗(yàn)2-4#中，將細(xì)胞以0.25-0.35x10⁶個(gè)/ mL的細(xì)胞密度接種到1L含有3.5g / L CB5的完全HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液（Hyclone）中，并在320F 1L攪拌罐反應(yīng)器中批次培養(yǎng)（37℃，pH7.15，DO 40％和80RPM）。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)≥5×10⁶ 個(gè)/mL時(shí)，開始誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后，用含有誘導(dǎo)劑的新鮮培養(yǎng)液開始灌流模式（1VVD）5-7天。在灌流過程中，使用miniBioSep（Applikon?）細(xì)胞保留（設(shè)置1 W功率）。通過NucleoCounter?NC-200?監(jiān)測反應(yīng)器每日細(xì)胞總數(shù)和活力。

在所有的灌流實(shí)驗(yàn)中，合并收獲物并將含有慢病毒載體的上清液置于冰上或4℃直至澄清（每天一次），隨后儲存在-80℃直至GTA分析。由于在研究中使用了兩種規(guī)格的生物反應(yīng)器，因此每升培養(yǎng)液中病毒滴度的總量（TU/L）可進(jìn)行直接比較。

已介紹過通過基于流式細(xì)胞術(shù)的基因轉(zhuǎn)移分析技術(shù)（GTA）測定功能性病毒滴度（GTA滴度）的方法。即將HEK293A或293T細(xì)胞在含有5％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在用LV轉(zhuǎn)導(dǎo)前5小時(shí)，將細(xì)胞以1E05個(gè)/孔的密度接種于24孔板上。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將LV樣品在補(bǔ)充有8g/ mL聚凝胺的DMEM培養(yǎng)液中連續(xù)稀釋，并在37℃溫育30分鐘。移除培養(yǎng)液，并向細(xì)胞中加入200μL稀釋后的LV樣品，然后37℃培養(yǎng)過夜。第二天，每孔補(bǔ)加800μL培養(yǎng)液，再培養(yǎng)48小時(shí)后，使用流式細(xì)胞術(shù)定量表達(dá)GFP的細(xì)胞。因此，需在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天測量GFP。注意，由于在對照試驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)10天后檢測到相似的信號，因此在測量時(shí)需確定實(shí)驗(yàn)中測得的GFP信號是否真正由轉(zhuǎn)基因表達(dá)，而不是附加體的存在(補(bǔ)充 Fig. 1)。滴度（TU / mL）使用公式[（GFP陽性細(xì)胞百分比/ 100）×（轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的數(shù)量）×（稀釋倍數(shù)）×（1mL /轉(zhuǎn)導(dǎo)體積）]。在所有測量中使用內(nèi)部LV標(biāo)準(zhǔn)以使批間差異最小化。

此前已經(jīng)介紹了一款包裝細(xì)胞系，此細(xì)胞系除了病毒RNA外含有包裝慢病毒的所有必需基因。此包裝細(xì)胞系名為PacLV，是在單次轉(zhuǎn)染操作中同時(shí)加入所有LV組分（Gag / Pol，Rev和VSV-G）。在包裝細(xì)胞中，Rev和包膜蛋白（VSV-G）的轉(zhuǎn)錄處于四環(huán)素和cumate開關(guān)的控制下，這意味著需要在培養(yǎng)液中添加多四環(huán)素和cumate以誘導(dǎo)LV的產(chǎn)生（圖1A）。而Gag/Pol 在CMV啟動子控制下。即使Gag / Pol的表達(dá)是結(jié)構(gòu)性的，并且不由開關(guān)直接控制，但其表達(dá)仍取決于REV響應(yīng)元件（RERE Responsive Element，RRE）的存在。然后構(gòu)建包含產(chǎn)生LV的所有元件（包括基因組RNA）的細(xì)胞系（稱為生產(chǎn)者）。為了便于滴定測定，我們選擇構(gòu)建表達(dá)GFP的慢病毒載體，并且其由強(qiáng)組成型CMV啟動子調(diào)控?？赏ㄟ^包含RRE的pCSII-CMV5-GFPq質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系來實(shí)現(xiàn)。并且先前已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于質(zhì)粒構(gòu)建的細(xì)節(jié)。將生產(chǎn)細(xì)胞系命名為clone 92。為了驗(yàn)證clone 92生產(chǎn)慢病毒的穩(wěn)定性，將細(xì)胞在搖瓶中培養(yǎng)10周，并在不同的時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)，檢測慢病毒的生產(chǎn)。整個(gè)過程中，慢病毒滴度均維持在3.0×10⁶TU/mL以上，表明clone 92是穩(wěn)定的（圖1B）。

為了評估clone 92在攪拌式生物反應(yīng)器中的性能，在SFM4TransFx293培養(yǎng)液（該細(xì)胞系的起始基礎(chǔ)培養(yǎng)液）中以3.5L規(guī)模進(jìn)行了4批培養(yǎng)（圖2）。誘導(dǎo)3天（dpi）后，細(xì)胞活力均達(dá)到70-80%，具有可重復(fù)性降低（圖2A）。慢病毒滴度生產(chǎn)動力學(xué)顯示，均在3dpi出現(xiàn)峰值，平均滴度為6×10⁶ TU / mL（圖2B）。從搖瓶到分批模式的生物反應(yīng)器培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)的線性放大（圖2C）。平均每升培養(yǎng)液的總LV產(chǎn)量為6×10⁹TU，具體產(chǎn)量為4.4TU /細(xì)胞（圖2D）。

為了解決慢病載體的低穩(wěn)定性，我們安排在灌流模式下使用連續(xù)收獲以實(shí)現(xiàn)慢病毒載體的快速生產(chǎn)。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，摸索了兩種搖瓶實(shí)驗(yàn)方案。首先，確定在細(xì)胞生長期期間每日更換培養(yǎng)液（DMR）的作用，并考察誘導(dǎo)時(shí)高細(xì)胞密度對產(chǎn)量的影響。在-3dpi和0dpi之間，每天使用0-100％新鮮SFM4Transfx293培養(yǎng)液進(jìn)行離心換液。結(jié)果表明，通過增加新鮮培養(yǎng)液的換液量可以延長細(xì)胞生長期；連續(xù)4天換液后，當(dāng)0dpi時(shí)，細(xì)胞密度可達(dá)到8×10⁶個(gè)/ mL，為批次對照的3倍（圖3A）。誘導(dǎo)3天后，檢測慢病載體含量，當(dāng)新鮮培養(yǎng)液更換體積為75％-100％時(shí)，病毒滴度可從無培養(yǎng)液替換時(shí)的1.0×10⁶ TU / mL增加至3.35×10⁷ TU / mL，具有顯著提高（圖3B）。與100% DMR相比，75% DMR具有更高的產(chǎn)量。這表明在誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生慢病毒載體的最佳細(xì)胞密度為通過75％DMR獲得的約5.5×10⁶個(gè)/ mL。

因此，在第二組小規(guī)模實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞密度定為5×10⁶個(gè)/ mL。測試了在細(xì)胞生長階段使用強(qiáng)化培養(yǎng)基和在生產(chǎn)階段使用DMR的混合系統(tǒng)。選擇使用一種不含水解產(chǎn)物并且具有較低批次間差異的新培養(yǎng)液（HyCell TM TransFx-H）。每天更換75％的培養(yǎng)液，并且當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5×10⁶個(gè)/ mL時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果表明SFM4TransFx293和HyCell TM TransFx-H所得病毒滴度無差異（補(bǔ)充表1）。為了在分批模式下達(dá)到更高細(xì)胞密度，在HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中補(bǔ)加Cell Boost（CB5），并且當(dāng)細(xì)胞生長到5×10⁶個(gè)/ mL時(shí)再進(jìn)行誘導(dǎo)；在生產(chǎn)階段期間，分別使用含有CB5及不含CB5的培養(yǎng)液每天更換50％(Fig. 3C)，結(jié)果表明，無論是否補(bǔ)加CB5均可在1dpi至3dpi得到相似的慢病毒滴度，但補(bǔ)充CB5卻可提高4dpi和5dpi的滴度(Fig. 3D)。數(shù)據(jù)表明，誘導(dǎo)前在強(qiáng)化培養(yǎng)基（具有CB5的HyCell TM TransFx-H）中可獲得與簡化灌流生物反應(yīng)器相似的細(xì)胞密度。另外，在生產(chǎn)階段添加CB5可能會通過提高細(xì)胞活力以延長細(xì)胞生產(chǎn)期。

根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇在進(jìn)行生物反應(yīng)器中灌流模式的參數(shù)。圖4為用于灌流模式下操作的示意圖。 第一組實(shí)驗(yàn)（Perfusion 1）作為參考使用SFM4TransFx293培養(yǎng)液在3.5L攪拌式生物反應(yīng)器中進(jìn)行生長和生產(chǎn)。每天0.5培養(yǎng)液體積開始灌流（VVD），并在誘導(dǎo)后增加至1體積。

為了簡化流程，采用于搖瓶相似的混合模式實(shí)施另外三組實(shí)驗(yàn)（Perfusion2-4），并且在含有CB5的1L HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中按分批模式擴(kuò)增細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度到達(dá)≥5×10⁶個(gè)/mL時(shí)開始誘導(dǎo)，并用含有CB5和誘導(dǎo)劑的新鮮培養(yǎng)液按1VVD開始灌流。如圖5A和5B所示，誘導(dǎo)后灌流實(shí)驗(yàn)1的細(xì)胞密度和活率與灌流實(shí)驗(yàn)2-4具有明顯差異，并且與沒有添加CB5的圖2A、3A、3C相似，誘導(dǎo)后細(xì)胞活力迅速降低，在5dpi時(shí)細(xì)胞活力僅有25%并停止實(shí)驗(yàn)。相比之下，灌流實(shí)驗(yàn)2-4中并未停止產(chǎn)毒且在誘導(dǎo)后細(xì)胞擴(kuò)增到17×10⁶個(gè)/mL，直至最終收獲時(shí)，存活率仍保持在80%以上（圖5A-B）。在灌流實(shí)驗(yàn)1中，在3dpi出現(xiàn)到滴度峰值（2-3×10⁷TU / mL），而對于灌流實(shí)驗(yàn)2-4，在4dpi出現(xiàn)峰值（圖5C）。在4批次灌流實(shí)驗(yàn)中的總滴度均在5-8×10¹⁰TU/L范圍內(nèi)，且灌流實(shí)驗(yàn)1的總滴度最高（圖5D）。在生物反應(yīng)器中檢測的滴度與收獲容器相當(dāng)（補(bǔ)充圖2）。與分批培養(yǎng)相比，4次灌流實(shí)驗(yàn)測得的平均滴度（2.2×10⁷TU / mL）比分批模式（6×10⁶ TU / mL）高近4倍（圖5 2B）。此外，由于每天收獲，灌流模式的所得總載體（高達(dá)8×10¹⁰ TU / L）比批處理模式多11倍（圖5B）。在分批模式中，誘導(dǎo)時(shí)的活細(xì)胞密度為1-1.5×10⁶個(gè)/ mL，而灌流模式中為5.4×10⁶個(gè)/ mL。與分批模式下的4.4.TU/細(xì)胞相比，灌流模式平均可達(dá)到11.5TU/細(xì)胞。

通過穩(wěn)產(chǎn)細(xì)胞株(clone 92)，我們制定了兩種在灌流高產(chǎn)實(shí)驗(yàn)方案。第一種方法使用基礎(chǔ)培養(yǎng)液SFM4TransFx293和灌流模式來增加細(xì)胞密度和病毒載體回收（圖3A-B和5A-B）。第二種方法中使用補(bǔ)加CB5的HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液：由于在誘導(dǎo)后才開始使用灌流模式，因此該方法可能簡單更操作（圖3C-D和5C-D）?？傊c分批模式相比，灌流模式可將病毒的總產(chǎn)量提高至15倍。盡管預(yù)期8×10¹⁰ TU / L的絕對病毒滴度是轉(zhuǎn)基因依賴性的，但是我們推測與分批模式相比，超過1個(gè)對數(shù)的產(chǎn)量將可轉(zhuǎn)移到其他轉(zhuǎn)基因。

在已描述的穩(wěn)產(chǎn)貼壁細(xì)胞系中，病毒滴度在1×10⁶至1.5×10⁸ 范圍內(nèi)。 然而，貼壁細(xì)胞系在大規(guī)模生產(chǎn)中存在明顯的局限性。本研究中，包裝細(xì)胞系和穩(wěn)產(chǎn)細(xì)胞系的母細(xì)胞系（HEK293SF3F6）已適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)²⁸。使用雙開關(guān)系統(tǒng)，即需要添加兩種誘導(dǎo)劑才可啟動病毒的合成，這是clone 92成功的一個(gè)關(guān)鍵因素，并且嚴(yán)格控制了慢病毒毒性因子的產(chǎn)生。在早期研究中，曾嘗試過只使用一個(gè)開關(guān)，但未獲得成功（結(jié)果未列出）。本研究中的生產(chǎn)細(xì)胞系可在懸浮狀態(tài)下培養(yǎng)，但培養(yǎng)尚需進(jìn)一步優(yōu)化。 例如，添加CB5可將高病毒滴度（> 10⁷TU / mL）時(shí)間延伸至超過4-5dpi，并且在誘導(dǎo)后可延緩細(xì)胞活力的下降，以維持細(xì)胞正常生長。CB5含有多種維持細(xì)胞活力的營養(yǎng)素，但某些組分（例如生長因子）可能對病毒產(chǎn)量產(chǎn)生反作用。實(shí)際上，在搖瓶實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)間段，通過比較CB5的添加情況，可以得出在每個(gè)補(bǔ)加CB5的孔內(nèi)，所得病毒滴度相當(dāng)，且均低的多（圖3C，D）。設(shè)想可通過平衡病毒生產(chǎn)（細(xì)胞毒素過程）與細(xì)胞狀態(tài)以開發(fā)一種連續(xù)的生產(chǎn)模式。 相反，在未添加CB5的SFM4TransFx293基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，截止3dpi病毒均可被快速釋放（圖4C和D）。在生長階段補(bǔ)加CB5并在生產(chǎn)階段去除CB5可能進(jìn)一步提高早期的產(chǎn)量。全面的代謝物分析以及CB5成分更詳細(xì)的分析也是有意義的，并支持在更高細(xì)胞密度下的誘導(dǎo)。

純化和下游加工同樣影響終產(chǎn)品的滴度。有研究表明，目前正在研究通過柱/膜色譜法以減少終產(chǎn)品中雜質(zhì)的含量。雖然Cumate具有非細(xì)胞毒性，但多西環(huán)素是四環(huán)素類抗生素，因此純化過程中還應(yīng)去除本研究添加的兩種誘導(dǎo)劑。即使終產(chǎn)品中只存有痕跡，但對于患有四環(huán)素過敏的人來說將會是一個(gè)大問題。

總之，據(jù)我們所知，本研究是第一個(gè)描述慢病毒載體穩(wěn)產(chǎn)HEK293懸浮細(xì)胞系的工藝開發(fā)和改進(jìn)。從小規(guī)模到1~3L級生物反應(yīng)器具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。本與研究評價(jià)了兩種改善慢病毒載體總產(chǎn)量的方案，且這兩種方案均在灌流模式下采用了超聲波細(xì)胞過濾技術(shù)。總的來說，實(shí)現(xiàn)了總病毒滴度（TU/L每升培養(yǎng)液）超過1個(gè)對數(shù)的增加。這意味著我們能夠在灌流模式下生產(chǎn)高達(dá)8 x 10¹⁰ TU / L的載體。預(yù)計(jì)所開發(fā)的生產(chǎn)工藝很適合大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化制造。

圖1：Clone 92的cumate誘導(dǎo)系統(tǒng)和穩(wěn)定性結(jié)果。A）在包裝細(xì)胞系和clone 92中，Rev和包膜蛋白（VSVG）的轉(zhuǎn)錄受四環(huán)素和cumate開關(guān)的控制；需在培養(yǎng)液中添加四環(huán)素和cumate才可誘導(dǎo)慢病毒載體的產(chǎn)生。Cumate可阻止cumate阻遏物（CymR）與cumate操縱子（CuO）結(jié)合。多西環(huán)素促進(jìn)四環(huán)素反式激活因子（rtTA2s-M2）與四環(huán)素啟動子（TR5）的結(jié)合。B）為了檢測clone 92的穩(wěn)定性，細(xì)胞在無選擇性培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)10周，并且在培養(yǎng)第2周，第6周和第10周后，取部分細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1.0×10⁶個(gè)/mL時(shí)，加入多西環(huán)素和cumate。通過基因轉(zhuǎn)移分析法（GTA）分析誘導(dǎo)后48h病毒的生成量（誤差線未標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

圖2：分批模式下在3L生物反應(yīng)器中獲得的結(jié)果。 A）使用SFM4TransFx293培養(yǎng)液及生物反應(yīng)器，以分批模式進(jìn)行4批獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（批次1至批次4）所測量的活細(xì)胞數(shù)量（黑線）和活力（灰線）。 B）4批次在誘導(dǎo)后3天內(nèi)的滴度動力學(xué)。 C）在3天時(shí)，4批次生產(chǎn)與相應(yīng)的搖瓶對照的病毒滴度結(jié)果。 內(nèi)部對照即在誘導(dǎo)后不久從生物反應(yīng)器中取樣，并分裝至搖瓶中進(jìn)行罐外培養(yǎng)。 外部對照是在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，即生長期和病毒生產(chǎn)階段，在搖瓶中平行進(jìn)行對照。 D）4批次實(shí)驗(yàn)中，每升培養(yǎng)液所產(chǎn)病毒總滴度。

圖3：搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 A）在SFM4TransFx293培養(yǎng)液中，每日培養(yǎng)液置換（DMR）0-100％后，在-4dpi和3dpi之間活細(xì)胞總數(shù)活（黑線）和活率（灰線）結(jié)果。 在-3dpi，-2dpi，-1dpi和0dpi時(shí)更換搖瓶中培養(yǎng)液。 B）通過通過基因轉(zhuǎn)移分析法（GTA）測定與圖A對應(yīng)的3dpi時(shí)病毒滴度（誤差線是標(biāo)準(zhǔn)偏差）。 C）含有3.5g / L Cell Boost 5?（CB5）（方形）和不含CB5（圓形）的HyCell TM TransFx-H培養(yǎng)液中活細(xì)胞總數(shù)及活率。 對于生產(chǎn)病毒的細(xì)胞懸液，在誘導(dǎo)后每24h用新鮮培養(yǎng)液（補(bǔ)加和不補(bǔ)加CB5兩種條件使用獨(dú)立搖瓶）以50％進(jìn)行DMR。 D）通過GTA檢測C組所示收獲液的滴度（TU / mL）（誤差線是標(biāo)準(zhǔn)偏差）。

圖4：示意圖為灌流模式中所使用的設(shè)備。使用接種瓶以0.25-0.35E06個(gè)/ mL將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器容器中。使用收集瓶和相關(guān)采樣器在無菌條件下進(jìn)行每日無細(xì)胞收獲和采樣（使用超生過濾器保留細(xì)胞并在收獲上清液的同時(shí)將其再循環(huán)到生物反應(yīng)器中）。每日從左側(cè)的采樣器取細(xì)胞并測量細(xì)胞密度和活率。將培養(yǎng)液保持在4℃并泵入容器中，使得在24小時(shí)內(nèi)每反應(yīng)器容積容器加入0.5-1體積的培養(yǎng)液；使用比例尺和水平檢測器可進(jìn)一步監(jiān)測添加的培養(yǎng)液的確切體積。氧氣（pO2），溫度和pH值用可消毒的探針進(jìn)行監(jiān)測。通過表面加入CO ₂或加入堿（NaHCO ₃）將pH維持在7.05和7.1之間。示意圖上還顯示了蠕動泵（一個(gè)圓圈中的倒三角形）。

圖5：4批灌流培養(yǎng)中細(xì)胞活力和滴度的測定結(jié)果。 在1-3.5L培養(yǎng)中誘導(dǎo)前后的活細(xì)胞數(shù)A）（VCC）和B）細(xì)胞活率B）。 C）使用GTA分析，4批實(shí)驗(yàn)每日采收液的病毒滴度（TU / mL）（在冰上收集的灌流濾液）。 D）對于所有批次實(shí)驗(yàn)1L培養(yǎng)液收獲病毒總和

補(bǔ)充表1：在兩種不同的培養(yǎng)基中病毒滴度結(jié)果。每日更換75%培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞密度約為5×10⁶個(gè)/ mL時(shí)開始誘導(dǎo)細(xì)胞，并通過GTA在3dpi測量滴度。

補(bǔ)充圖1：

在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天和10天分別進(jìn)行GFP表達(dá)定量。 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間沒有顯著差異。 誤差線為對應(yīng)3種不同稀釋度的每個(gè)樣品3次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

參考文獻(xiàn)：

Manceur AP, Kim H, Misic V, et，al.Scalable Lentiviral Vector Production Using Stable HEK293SF Producer Cell Lines.Hum Gene Ther Methods. 2017 Dec;28(6):330-339. doi: 10.1089/hgtb.2017.086. Epub 2017 Nov 21.

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