細(xì)胞外囊泡（EV）是高度專業(yè)化的納米級(jí)組件，其遞送復(fù)雜的生物貨物以介導(dǎo)細(xì)胞間通信。 EV是異質(zhì)的，并且這種異質(zhì)性的表征對(duì)于理解EV生物發(fā)生和活性以及將它們與生物反應(yīng)和病理學(xué)相關(guān)聯(lián)是至關(guān)重要的。研究EV組成的傳統(tǒng)方法通常缺乏表征個(gè)體EV的分辨率和/或靈敏度，因此EV異質(zhì)性的評(píng)估仍然具有挑戰(zhàn)性。

1月16號(hào)澳大利亞悉尼大學(xué)悉尼藥學(xué)院團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表了文章“High-fidelity probing of the structure and heterogeneity of extracellular vesicles by resonance-enhanced atomic force microscopy infrared spectroscopy”，該團(tuán)隊(duì)最近開發(fā)了一種原子力顯微鏡紅外光譜（AFM-IR）方法，用于探測(cè)具有納米級(jí)分辨率的單個(gè)EV的結(jié)構(gòu)組成。在這里，該方法提供了逐步的程序，并展示了其在同一EV和不同EV群體之間揭示個(gè)體EV異質(zhì)性的能力。此方法無(wú)標(biāo)記，能夠檢測(cè)單個(gè)EV中的脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和核酸。在從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離EV后，該方案涉及將EV樣品在合適的基質(zhì)上孵育，設(shè)置AFM-IR儀器并收集納米IR光譜和納米IR圖像。數(shù)據(jù)采集和分析可在24小時(shí)內(nèi)完成，僅需要光譜學(xué)和化學(xué)的基本知識(shí)。預(yù)計(jì)通過(guò)AFM-IR對(duì)EV組成和結(jié)構(gòu)的新認(rèn)識(shí)將有助于我們對(duì)EV生物學(xué)的生物學(xué)理解，并可用于疾病診斷和EV療法的開發(fā)。

Figure 1:用于EV的AFM-IR光譜的工作流程。

Figure 2:納米紅外光譜收集前的系統(tǒng)優(yōu)化。a,快速傅立葉變換（FFT）信號(hào)，在不同頻率下顯示清晰，明顯的峰值，表示激光器的正確對(duì)準(zhǔn)。 b,懸臂振鈴信號(hào)顯示一致的波形，表示正確對(duì)準(zhǔn)的紅外激光，并證明樣品在特定波數(shù)處顯示出一些吸光度。 c,優(yōu)化不同波數(shù)的激光熱點(diǎn)，其中紅點(diǎn)對(duì)應(yīng)于信號(hào)的最高強(qiáng)度，藍(lán)色對(duì)應(yīng)于最弱的強(qiáng)度。

Figure 3:從缺氧培養(yǎng)的DMSC23細(xì)胞收集的DMSC23 EV的AFM-IR光譜的收集。a,AFM-IR光譜，證明了同一EV群體內(nèi)不同顆粒的異質(zhì)結(jié)構(gòu)和組成。 b,相應(yīng)的DMSC23 EV的AFM高度圖像，藍(lán)色和紅色網(wǎng)格指示收集a中AFM-IR光譜的位置。

Figure 4:AFM-IR圖像，其具有從CMSC29和DMSC23細(xì)胞分離的EV亞群的相應(yīng)平均光譜。a,CMSC29 EV：AFM-IR高度圖像，在1,650 cm-1記錄的納米紅外圖像，顯示酰胺I的分布和AFM-IR光譜。 b,DMSC23 EVs：AFM-IR高度圖像，在1600cm-1處記錄的納米紅外圖像，其呈現(xiàn)核酸的分布和AFM-IR光譜。

Figure 5:來(lái)自各個(gè)EV上的多個(gè)點(diǎn)的AFM-IR光譜的集合。a-c,單個(gè)DMSC23 EV和CMSC29 EV（a）的12個(gè)平均AFM-IR光譜的比較，以及DMSC23 EV（b）和CMSC29 EV（c）的相應(yīng)AFM高度圖像。

盡管在過(guò)去十年中開發(fā)了許多先進(jìn)的EV表征方法，但由于傳統(tǒng)技術(shù)的靈敏度和分辨率的限制，破譯單個(gè)EV的結(jié)構(gòu)和組成仍然是難以捉摸的挑戰(zhàn)。用于表征單個(gè)EV的常規(guī)納米級(jí)技術(shù)僅限于獲得關(guān)于顆粒形態(tài)，大小和數(shù)量的信息，而不是研究它們的分子組成。此外，許多這些技術(shù)需要熒光探針，這是一個(gè)重要的限制。然而，它們的關(guān)鍵限制是它們檢查大量EV樣品而不是亞種群或單個(gè)EVs。目前，需要大量的EV，并且由于傳統(tǒng)技術(shù)的分辨率不足，僅獲得來(lái)自相對(duì)大的群體的平均信號(hào)。因此，迫切需要開發(fā)新的方法來(lái)詢問亞群和個(gè)體囊泡，以使EV科學(xué)能夠進(jìn)一步快速地進(jìn)展。更好地了解EV的分子組成和異質(zhì)性是設(shè)計(jì)下一代生物傳感器以進(jìn)行早期疾病診斷和開發(fā)基于EV的新興療法的基礎(chǔ)，這已經(jīng)在癌癥診斷和治療中顯示出巨大的前景。

該實(shí)驗(yàn)使用AFM-IR以~20 nm的超高分辨率詢問整個(gè)EV群體，亞群和個(gè)體EV的組成和結(jié)構(gòu)。使用這種方法來(lái)證明能夠測(cè)量相同EV群體中或從兩種類型的胎盤干細(xì)胞系中分離的不同EV群體之間的個(gè)體EV的分子組成之間的細(xì)微差異。在不久的將來(lái),EV的AFM-IR表征極有可能釋放EV作為診斷和治療工具的全部潛力。預(yù)計(jì)AFM-IR介導(dǎo)的EV表征可以用作使用液體活檢的疾病早期診斷的工具，以及用于靶向治療的選擇所需的EV亞群。特別地，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞衍生的EV被深入研究，用于受損或患病組織的再生,并且與全細(xì)胞相比,EV的臨床施用被認(rèn)為是更安全和更實(shí)用的。通過(guò)EV結(jié)構(gòu)內(nèi)治療劑的功能化和內(nèi)化，開發(fā)用于精確治療的EV和作為天然藥物載體的EV的開發(fā)已經(jīng)成為最近EV研究的焦點(diǎn)，特別是在癌癥治療領(lǐng)域。我們期望使用AFM-IR來(lái)解決EV的異質(zhì)性并更好地理解亞群的獨(dú)特分子特性將釋放EV的全部臨床潛力。

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