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五、 目前個人認(rèn)為生物醫(yī)學(xué)研究的瓶頸就是是否能制備高質(zhì)量的適合多種用途的抗體。很多所謂的主流研究方法都要依賴抗體。例如Western blot,免疫熒光，流式分析，ELISA，IP，CoIP, ChIP。個人對抗體制備的原理和方法不是很清楚，但是實際過程中很多并不想說明書上說的那樣，結(jié)果是否漂亮，只有用了才知道。Western blot應(yīng)該是抗體的最基本功能，他的最后原理是抗體結(jié)合到膜上的抗原，然后通過二抗來顯示其位置。免疫共沉淀的抗體就不一樣了，他要保證能夠?qū)⒛愕哪繕?biāo)蛋白及其復(fù)合物牢固的結(jié)合并通過蛋白A或G將其沉下來。 舉個簡單的例子說明二者的不同，不知道是否正確，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在床上（膜）可能很容易辦到，上述過程類似WB，抗體的功能只是識別固定物（轉(zhuǎn)膜）上的抗原，風(fēng)平浪靜。相反，一男（抗體）與一女（抗原）熱情的接吻，在激流中就不容易辦到，上述過程類似免疫沉淀，是動態(tài)環(huán)境下的識別，而且必須特異性的牢固結(jié)合，這種接吻要求是熱吻，緊密結(jié)合，并且最終用一個鉤子（免疫沉淀中叫蛋白A或G)將男的勾下來后，要保證男的還熱吻者那個女的（即抗原）。因此要求這個男的（抗體）要緊緊的抱住那個女的（抗原）?？上攵ち髦校庖叱恋恚δ械馁|(zhì)量要求更高，一定要保證不與女的分手。如果男的還三心二意，可能抱的是其他的女人，這在免疫沉淀中就會產(chǎn)生非特異性條帶。因此，免疫沉淀一定要設(shè)置對照IG抗體來沉淀，如果隨便一個男的（對照IG）也能將某個女的抱下來，那這個女的就是“博愛”，不是真正需要的最愛（特異條帶）。鑒于目前很多男的（抗體）質(zhì)量不可靠或者不能滿足，因此大量的文獻(xiàn)喜歡采用標(biāo)簽蛋白（例如，HIS,HA,GFP，MYC等）作為“特異男”來勾引“女”的。 個人認(rèn)為需要一個個試，看那個能夠用于免疫沉淀，有的抗體是針對男的“嘴巴”來設(shè)計的，這種抗體當(dāng)然能夠容易將女的抱下來，相反有的是針對其他部位設(shè)計制備抗體的，功能也就不一樣了。Co-Ip成功的關(guān)鍵主要有兩個：1）男的質(zhì)量。2）男女接吻時的環(huán)境（例如是否有其他干擾因素，沉淀的時間，溫度，比例，旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度等） 不對指正。 六、 想說下免疫沉淀，免疫沉淀是用你的抗體富集目的抗原，然后用WESTERN顯示，你的抗體是否結(jié)合抗原。由于是富集了目的抗原，WESTERN不容易做出來的，用免疫沉淀可能容易出結(jié)果，但是也容易出雜帶。如果看兩個分子是否相互作用，可以用免疫共沉淀。 染色質(zhì)免疫沉淀（EMSA）主要用于研究轉(zhuǎn)錄因子的。實驗技巧是為了實驗?zāi)康姆?wù)的，撇開實驗?zāi)康?，單純討論實驗技巧，似不可取。另外建議：發(fā)現(xiàn)很多戰(zhàn)友發(fā)貼，不注明實驗?zāi)康?，這樣討論，可能最后發(fā)現(xiàn)所討論的實驗技術(shù)并不是為你的實驗?zāi)康姆?wù)的。 七、 關(guān)于抗體的問題，我的看法是： 1. 對應(yīng)WB而言，使用的抗體識別的抗原應(yīng)該是線性化的抗原（SDS）的作用，因此它識別的不是蛋白在具有正?？臻g結(jié)構(gòu)時的抗原決定簇，而是在蛋白一級結(jié)構(gòu)上相臨的幾個AA組成的抗原決定簇。 2. 對應(yīng)FACS而言，多數(shù)情況下，它識別的是具有正常高級結(jié)構(gòu)的蛋白的抗原決定簇，這些抗原決定簇可能是由相鄰近的AA組成的或者是由于蛋白折疊后原本在一級結(jié)構(gòu)上相距比較遠(yuǎn)的幾個AA組成的，因此WB和FACS的抗體有時能夠通用，有時不能通用。 3. Co-IP的情況，我認(rèn)為和FACS是相類似的。 4. ChIP的情況最為頭痛，因為它涉及了一個crosslink的過程，這個可能造成一些抗原決定簇被封閉掉，而且在免疫共沉淀使用的buffer中含有一些變性劑，進(jìn)一步影響了抗原抗體的結(jié)合，因此WB可以用的抗體并不一定能用于ChIP，按照現(xiàn)在的說法，如果不是被validated過的抗體，做ChIP可能需要對多個抗體進(jìn)行優(yōu)化評估靈敏性和特異性。 至于是固相雜交還是液像雜交我覺得到不是重點，事實上，和固態(tài)的蛋白芯片相比較，液態(tài)蛋白芯片（luminex）的效率更高，因為抗原抗體有更加充分的機(jī)會接觸。 八、 我想說的是不管是co-IP還是ChIP,一定要有陰性control，也就是和一抗相同來源的normal IgG。因為珠子本身可以吸附一定的蛋白和DNA，包括一些抗原抗體的非特異性結(jié)合，所以很多時候陰性control和實驗組時間是量的差別，而不是有或無的關(guān)系。 九、 建議： 1. 有一種免疫沉淀的方案是有“radioactivesupernatant”，我們一般做的是不用同位素的免疫沉淀方案的，看具體的實驗?zāi)康牧恕?/div> 2. santa cruz的抗體寫了可以做IP，但是出廠不檢驗，看你的運氣了，要多摸索條件。 3. 你的抗原是在細(xì)胞膜上還是在細(xì)胞核上，可根據(jù)情況選擇裂解液。 4. 免疫沉淀的結(jié)果最好同時有WESTERN對照，這樣可以知道是否成功沉淀了特異性條帶。免疫沉淀本身還有個陰性對照。 5. 實驗注意低溫，操作細(xì)心。 十、 再次有問請教這里的前輩，我把IP下來的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后進(jìn)行WESTERN BLOT 或者考馬斯亮藍(lán)染色，WESTERN BOT可以明顯看到我用于沉淀的蛋白，灰度幾乎和抗體的重鏈差不多，可是考染的結(jié)果卻只能看到重鏈和輕連，銀染也是這樣子，這可怎么辦呢？我的目的就是要比較沉下來的東西有什么差別。沉下來的東西直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定應(yīng)該怎么處理呢？如果你的蛋白和IgG的分子量差不多，則需要制作標(biāo)簽融合蛋白，以方便洗脫IgG和beads。 具體如下： 1. 制作含標(biāo)簽（如myc）的目的蛋白克隆載體。 2. 用含anti-myc的beads，pull-down目的蛋白。 3. 最后洗的時候，要有一次用myc的peptide洗脫液進(jìn)行洗脫beads和anti-myc。 4. 這時上清就只含有你的目的蛋白，而去除了IgG. |
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