全球每年約有60萬人患頭頸鱗狀細胞癌 (head andneck squamous cell carcinomas，HNSCCs)。HNSCCs的特點是在表型組學(xué)、病因?qū)W、生物學(xué)和臨床上均表現(xiàn)出異質(zhì)性。吸煙是導(dǎo)致發(fā)展中國家HNSCC發(fā)病人數(shù)增長的重要原因之一，而人乳頭瘤狀病毒(HPV)則是導(dǎo)致發(fā)達國家中不吸煙者患口咽部腫瘤的重要因素。盡管可以通過手術(shù)、放療和化療進行治療，但仍會導(dǎo)致大約一半的患者死亡。HNSCC的風(fēng)險程度是根據(jù)腫瘤的解剖部位，分期和組織學(xué)特征進行分級。除了HPV之外，許多已經(jīng)被研究的分子和臨床風(fēng)險因素也具有一定的臨床效果。

樣本選擇：

樣本共279例，其中口腔癌172例，口咽癌33例，喉癌72例，喉咽癌2例，大多數(shù)患者為男性（n= 203，73％）和重度吸煙者(平均煙齡51年）。36例為HPV（+），243例為HPV（-）。

DNA和RNA結(jié)構(gòu)變化

大部分腫瘤樣本中都存在拷貝數(shù)變化（copy numberalterations，CNAs），比如染色體3p、8p區(qū)域部分缺失，3q、5p和8q區(qū)域部分擴增（圖1a），在肺鱗狀細胞癌（LUSCs）中也有類似情況存在（圖1a）。通過分析微陣列數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)HNSCC基因組CNAs（擴增或缺失）平均值達到141，表現(xiàn)出較高的不穩(wěn)定性。通過“高覆蓋度”的全基因組分析確定了平均每個腫瘤有62個結(jié)構(gòu)畸變（染色體融合）（n = 29）。研究人員發(fā)現(xiàn)存在39個復(fù)發(fā)性(recurrent)拷貝數(shù)缺失區(qū)域和23個復(fù)發(fā)性拷貝數(shù)擴增區(qū)域（q <0.1）。hpv（+）和（-）的腫瘤都存在3q26 28區(qū)域復(fù)發(fā)性局部擴增，3q26="">

HPV（+）腫瘤的特征是存在TNF(腫瘤壞死因子)受體相關(guān)因子3（TRAF3）的截短突變(truncating mutations)（n =3，8％）和新型復(fù)發(fā)性缺失（n =5，14％）。TRAF3與天然免疫相關(guān)，此外還與獲得性抗病毒應(yīng)答相關(guān)，相關(guān)病毒包括Epstein–Barr，HPV和HIV。TRAF3缺失(變異)能促使NF-κB信號通路的異常激活。據(jù)研究人員所知，雖然之前在血液惡性腫瘤和鼻咽癌的相關(guān)文章中曾涉及到TRAF3蛋白失活，但這是首次將TRAF3蛋白與HPV相關(guān)癌癥聯(lián)系到一起。HPV（+）腫瘤在E2F1基因區(qū)域存在顯著局部擴增，并且大部分HPV（-）腫瘤在包含 CDKN2A基因的9p21.3區(qū)域存在缺失。

HPV（-）腫瘤的特征是存在11q13和11q22區(qū)域的共擴增(co-amplifications)，共擴增區(qū)域內(nèi)存在與細胞死亡相關(guān)的/NF-kB和Hippo信號通路基因。此外，部分HPV(-)腫瘤在核SET域基因(nuclear set domain gene)以及腫瘤抑制基因內(nèi)存在新的局部缺失。大部分HPV（-）腫瘤中受體酪氨酸激酶都存在復(fù)發(fā)性局部擴增。通過CNAs的無監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)了一個互相排斥的子類，這個子類中大部分樣本都是CNAs數(shù)量減少的口腔癌樣本，在癌癥中也被叫做‘M’類(該類腫瘤由突變驅(qū)動，而不是CNA)(圖1b)。這個子類中的樣本具有一種新三基因模式(new three-gene pattern)，在此模式下，HRAS內(nèi)突變被激活，CASP8突變和野生型TP53失活。野生型TP53、突變HRAS和CASP8，這三個基因的組合(constellation)表明了存在另一種涉及RAS和/或細胞死亡/NF-kB信號通路變化的腫瘤發(fā)生通路

圖1 DNA拷貝數(shù)變化

為了檢測是否存在新的結(jié)構(gòu)改變，研究人員對全基因組和RNA-Seq數(shù)據(jù)進行分析。實體瘤內(nèi)已經(jīng)發(fā)表的融合致癌基因，例如涉及ALK，ROS或RET的基因，在HNSCC樣本中均未觀察到。先前發(fā)表的FGFR3-TACC3融合發(fā)生于兩例HPV（+）腫瘤中。在279例患者中，只有1例是先前在相關(guān)文章中發(fā)表過的EGFR（vIII）亞型—— III型。雖然研究人員沒有發(fā)現(xiàn)新的致癌基因融合，但通過幾個樣本發(fā)現(xiàn)EGFR或FGFR3的1號外顯子與非復(fù)發(fā)性伴侶（non-recurrentpartners）發(fā)生融合，表明伴侶基因存在潛在啟動子互換。在兩個HPV（ - ）腫瘤中發(fā)現(xiàn)了低概率的選擇性MET轉(zhuǎn)錄物(alternative MET transcription)，其中14號外顯子被跳過，這一發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌領(lǐng)域意義重大。結(jié)構(gòu)改變（純合子缺失，染色體內(nèi)和染色體間融合）通常與腫瘤抑制基因中的功能喪失相關(guān)，其中最顯著的是CDKN2A，其次是TP53，RB1，NOTCH1和FAT1。編碼蛋白融合(protein-codingfusion events)反而與抑制基因的功能喪失之間聯(lián)系不大。RNA測序數(shù)據(jù)分析表明HNSCC中某些基因存在選擇性剪切，比如基因KLK12和TP63。

通過DNA分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)HPV（+）腫瘤存在宿主基因組整合，通常發(fā)生在腫瘤的單個基因組位置，并且?guī)缀蹩偸桥c宿主基因組的擴增相關(guān)聯(lián)。通過分析RNA轉(zhuǎn)錄本，證實存在跨病毒-人基因座轉(zhuǎn)錄。然而，沒有檢測到相關(guān)基因，這表明HPV整合不是由單一驅(qū)動機制驅(qū)動。類似地，在HPV（+）細胞系中的MYC基因中也沒有檢測到整合位點。

2.體細胞突變

全外顯子測序分析鑒定出發(fā)生體細胞突變的基因，許多突變基因都位于CNAs區(qū)域并且在COSMIC數(shù)據(jù)庫中被標注出來（圖2）。目標基因的平均測序覆蓋度為95×，82％的目標基因覆蓋度在30×以上。在279個樣品中，檢測到來自單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫（dbSNP）的 12,159個同義體細胞突變體，37,061個非同義體細胞突變體和2,579個種系單堿基替換。394個特定區(qū)域的靶向重新測序確定了99％發(fā)生了突變。分析突變等位基因表達產(chǎn)物RNA確定了86％病例中存在變異。HPV（-）腫瘤中大多存在CpG位點的翻轉(zhuǎn)，而HPV（+）腫瘤中TpC突變較為頻繁，突變率并沒有因HPV狀態(tài)(陰性或陽性)不同而有所不同，這一點與之前發(fā)表文章所述相反。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，突變基本在11個基因上富集（圖2）。導(dǎo)致失活性突變（通過無義，移碼或剪接位點突變提前終止蛋白質(zhì)翻譯）的4個基因基本都出現(xiàn)在HPV（-）腫瘤中。有2個基因與細胞周期和生存相關(guān)（CDKN2A（P<><0.01）），有2個基因與wnt><0.01），ajuba（p=0.14））。研究人員發(fā)現(xiàn)86％的hpv（-）樣本中都會發(fā)生tp53突變，而36例hpv（+）中只有1例具有非同義tp53突變。體細胞突變和ajuba缺失主要是由于功能性lim域5'端發(fā)生失活突變和錯義突變聚類，ajuba是一種調(diào)節(jié)細胞分裂，脊椎動物纖毛形成和左右軸確定（left–rightaxis determination）的中心體蛋白。此外，atm(ataxia telangiectasia-mutated，毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變蛋白)和atr(atm="" 和rad-3相關(guān)蛋白)激酶能夠調(diào)節(jié)dna損傷應(yīng)答反應(yīng),在腫瘤的入侵和遷移的前提下，ajuba具有依賴egfr-ras-mapk的磷酸化作用的傾向，且與hippo生長和再生通路（hippo="" growth="" and="">

圖2  HNSCC中的顯著突變基因

33例HNSCCs中存在NSD1(核受體結(jié)合SET 域蛋白1)頻繁突變，突變包括失活突變(n=29)和局部純合子缺失(n=4)。NSD1是類似于SETD2的組蛋白賴氨酸(H3K36)甲基轉(zhuǎn)移酶。NSD1失活突變的種系攜帶者存在患顱面畸形和惡性腫瘤的風(fēng)險，這表明NSD1是一個腫瘤抑制基因。有趣的是，在融合白血病中的NUP98基因時，NSD1又起到致癌基因的作用。涉及其他專一性H3K36甲基轉(zhuǎn)移酶基因(WHSC1)的易位發(fā)生在20%的多發(fā)性骨髓瘤病例中。NSD1的缺失與散發(fā)性非黑色素瘤皮膚癌有關(guān)。顯著突變基因(NOTCH1,19%)常與鱗狀分化相關(guān)的變異有關(guān),其余非顯著突變家族成員(NOTCH2,9%和NOTCH3,5%)，TP63和ZNF750在17q25.3的位置有顯著的缺失峰。研究分析確定了一些新的顯著突變，例如在TRAF3，RB1和NFE2L2內(nèi)。頻繁突變的凋亡基因CASP8在第一個死亡效應(yīng)子，內(nèi)含子和半胱氨酸蛋白酶肽酶結(jié)構(gòu)域中存在聚類錯義突變和失活突變。KMT2D（也稱為MLL2）和HLA-A在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著突變可能導(dǎo)致免疫監(jiān)視的缺陷。在已知的致癌基因的統(tǒng)計學(xué)分析中，只有PIK3CA突變達到統(tǒng)計學(xué)顯著水平。PIK3CA突變中約有四分之一的病例存在并發(fā)擴增(concurrentamplification)，還有20％的腫瘤存在局部擴增但卻沒有突變的跡象。73％的PIK3CA基因突變位于Glu542Lys，Glu545Lys以及His1047Arg/Leu熱點區(qū)域有促進激活的作用，其余的突變功能還不明確。

研究人員將顯著突變基因和COSMIC上發(fā)表的基因的無監(jiān)督全基因組分析擴展到亞組分析，通過解剖位點、腫瘤狀態(tài)與正常狀態(tài)、HPV狀態(tài)等樣本信息和四個先前驗證的基因表達產(chǎn)物對亞組加以區(qū)分。新確定的突變包括TRAF3，RB1和NFE2L2，研究人員還確定了HRAS等基因的突變在統(tǒng)計學(xué)上達到顯著水平。散發(fā)性失活突變和TGFBR2缺失主要存在于口腔癌中，與其在小鼠模型中具有促進鱗狀腫瘤發(fā)生的作用相吻合。COSMIC數(shù)據(jù)庫中突變基因的研究集中在包含F(xiàn)BXW7基因的4q31.3處的顯著缺失峰（一種靶向cyclin E和NOTCH基因的泛素連接酶），在該缺失峰處研究人員發(fā)現(xiàn)了復(fù)發(fā)性Arg505 Gly / Leu替換（n=14）。至少具有一個與先前在COSMIC上發(fā)表的相同突變的基因包括SCN9A，CHEK2，PTCH1和PIK3R1。對于潛在藥物作用靶點相關(guān)的體細胞突變和蛋白表達，研究人員會繼續(xù)關(guān)注。

圖3  候選治療靶點和致癌基因驅(qū)動

3.整合基因組分析和通路分析

通過相關(guān)的基因組改變分析，發(fā)現(xiàn)了很多重要信息。 例如，包含CCND1，F(xiàn)ADD和CTTN基因的11q13區(qū)域與可能包含YAP1和BIRC2的11q22區(qū)域發(fā)生共擴增。染色體11q22在與11q13發(fā)生共擴增的區(qū)域下很少擴增。 這個新的發(fā)現(xiàn)表明，這種共擴增的選擇壓力源于BIRC2與FADD的相互作用和抑制細胞死亡的胱天蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)。 值得注意的是，在11q13區(qū)域發(fā)生擴增的絕大多數(shù)腫瘤在11q22的端粒區(qū)域（包括在癌細胞死亡中有重要作用的基因如ATM和CASP1,4,5,12）會存在大量缺失。

基因表達產(chǎn)物亞型可分為類atypical(24％),mesenchymal(27％),basal(31％)和classical(18％)。值得注意的是，TP53突變，CDKN2A功能喪失，染色體3q擴增，氧化應(yīng)激基因（KEAP1，NFE2L2或CUL3）改變，重度吸煙史和larynx sub-site常常同時出現(xiàn)在classical類腫瘤中。 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，NFE2L2氧化應(yīng)激通路是跨腫瘤位點的與煙草相關(guān)的標記。

相比之下，basal類腫瘤具有完整的氧化應(yīng)激通路信號，只有少量的3q染色體改變和NOTCH1失活。對3q區(qū)域的分析顯示，相對于所有其他類中的HNSCC樣品和癌細胞周邊組織樣品，basal類腫瘤中SOX2表達量較低。此外，basal類腫瘤大多具有HRAS-CASP8共突變或11q13 / q22共擴增的特征。綜合以上發(fā)現(xiàn)和HRAS突變，可以確定破壞細胞死亡是basal類腫瘤的主要特性。Atypical類腫瘤的特征是缺乏7號染色體擴增，并且包括很多9號外顯子區(qū)域激活突變的HPV(+)腫瘤。相比之下，mesenchymal類腫瘤表現(xiàn)出高水平的先天免疫基因的改變，特別是自然殺傷細胞markerCD56的高水平表達和HLA I類 的低頻率突變。在顯著突變的基因中，TP53，CASP8，NSD1和CDKN2A解剖部位來源差異最大。CASP8突變常出現(xiàn)在口腔癌中（n=22，92％），口咽癌中TP53，NSD1和CDKN2A位點的突變頻率較其他位點低。

通過對不同HPV狀態(tài)下腫瘤的反相蛋白陣列、DNA甲基化、miRNA平臺的無監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)一些聚類具有跨平臺的高相關(guān)性（圖4），并存在基因協(xié)調(diào)改變。在更復(fù)雜的跨平臺分析中發(fā)現(xiàn)，分子亞型與單基因改變存在聯(lián)系，例如，在atypical類和classical類中均檢測到NSD1低甲基化以及功能喪失性突變，還檢測到了野生型NOTCH1。

對miRNA，基因表達和DNA甲基化數(shù)據(jù)進行監(jiān)督聚類分析，發(fā)現(xiàn)了與解剖部位相關(guān)的基因組特征以及HNSCC 中miRNA反向調(diào)節(jié)的靶基因 。在這些miRNA-信使RNA網(wǎng)絡(luò)中，let-7c-5p和miR-100-5p的表達情況與低拷貝數(shù)相關(guān)。與正常細胞相比，腫瘤細胞中l(wèi)et-7c-5p和miR-100-5p的表達量較低。 這些miRNA的表達和遺傳信息的缺失與靶基因（包括細胞周期調(diào)節(jié)劑CDK6，轉(zhuǎn)錄因子E2F1，有絲分裂調(diào)節(jié)劑PLK1和轉(zhuǎn)錄因子HMGA2）表達量增加高度相關(guān)。

圖4  綜合分析基因組變化

綜合生物信息學(xué)分析，根據(jù)頻繁變化的基因組區(qū)域確定了幾條通路（圖5）。受體酪氨酸激酶，EGFR/ERBB2,FGFR1/3的基因組改變較為頻繁。在受體酪氨酸激酶（RTK）/ RAS /磷脂酰肌醇-3-OH激酶（PI(3)K）通路的下游靶點，PIK3CA偶爾會使基因HRAS和PTEN發(fā)生改變。在該通路更下游區(qū)域，幾乎每個樣本控制細胞周期的基因都發(fā)生了改變。在HPV(-)腫瘤中，腫瘤抑制基因TP53和CDKN2A，致癌基因CCND1和MYC以及miRNAlet-7c常常發(fā)生改變，在HPV（+）腫瘤中，則通常是病毒基因E6，E7和E2F1發(fā)生改變。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)涉及細胞死亡，NFkB介導(dǎo)的信號存活反應(yīng)和免疫信號通路的基因頻繁改變。 FADD±BIRC2或CASP8±HRAS共擴增只發(fā)生在HPV（-）腫瘤中，而TRAF3缺失也只存在于HPV（+）腫瘤中。TRAF3和HLA的缺失與先天抗病毒免疫和適應(yīng)性抗腫瘤免疫失調(diào)有關(guān)。還發(fā)現(xiàn)NOTCH，TP63和其他一些HPV（-）腫瘤中的基因與β-連環(huán)蛋白（CTNNB1）相關(guān)。此外，NFE2L2是氧化應(yīng)激反應(yīng)中一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子受體，可以圍繞它展開進一步研究。

圖5  信號通路和轉(zhuǎn)錄因子失調(diào)

該文章進行了較為全面的HNSCC綜合基因組分析。HPV（+）口咽癌中TRAF3缺失、PIK3CA突變激活、E2F1擴增表明存在NF-kB通路、其他致癌通路、細胞周期相關(guān)通路的異常激活。在HPV（-）HNSCCs中，互相排斥的子集(mutuallyexclusive subsets)包括含有CCND1,FADD,BIRC2,YAP1的11q擴增子，和CASP8,HRAS的并發(fā)突變，以及細胞周期、細胞死亡、NF-kB、其他致癌基因通路。最近研究表明，AJUBA,FAT1,NOTCH1的失活可能會導(dǎo)致Wnt / β-catenin信號通路失活，這與細胞極性和特異性失調(diào)有一定關(guān)系。HPV（+）和HPV（-）腫瘤中發(fā)現(xiàn)3q擴增子(包括轉(zhuǎn)錄因子TP63,SOX2和信號分子PIK3CA)與上皮干細胞穩(wěn)態(tài)和細胞分化有關(guān)。BIRCs，PI(3)K，Wnt/β-catenin和Notch的生物學(xué)功能和靶向藥物還在進一步研究中。以上發(fā)現(xiàn)為研究HNSCC提供了新的思路，可以針對一些突變進行更深入的研究，也許能對腫瘤的預(yù)防和治療提供一些幫助。

參考文獻：

[1] The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive genomic characterization of headand neck squamous cell carcinomas[J]. Nature, 2015,517: 576–582.