德國科學(xué)家Ugur Sahin及其團(tuán)隊(duì)首次將一種以RNA為基礎(chǔ)的個(gè)性化疫苗治療方案應(yīng)用于人體， 該療法對(duì)每位病人基因組上檢測到的突變進(jìn)行新抗原預(yù)測，然后設(shè)計(jì)個(gè)性化疫苗。通常，自然條件下的免疫系統(tǒng)識(shí)別癌細(xì)胞的效率極低，而他們所提出的這種疫苗能夠激發(fā)免疫系統(tǒng)，以一種靶向性的方式來對(duì)抗腫瘤。

免疫治療（immunotherapy）是指機(jī)體對(duì)抗原的識(shí)別能力低下，通過人為的增強(qiáng)或抑制機(jī)體的免疫功能來達(dá)到治療疾病的目的。自然條件下人體免疫系統(tǒng)識(shí)別腫瘤細(xì)胞的效率極低，因此德國科學(xué)家Ugur Sahin及其團(tuán)隊(duì)介紹了個(gè)性化腫瘤疫苗的概念，采用了一種基于RNA的多重表位方法，激活免疫系統(tǒng)來對(duì)抗腫瘤。研究人員利用了10個(gè)突變位點(diǎn)的遺傳信息來實(shí)現(xiàn)合成過程，使得能夠在幾個(gè)地方同時(shí)攻擊腫瘤，確保了腫瘤無力進(jìn)行抵抗。此次研究首次應(yīng)用在人體黑色素瘤中。

樣品選擇：符合具有完全緩解、部分緩解或疾病穩(wěn)定的惡性黑色素瘤III期或IV期的13位成年人。

實(shí)驗(yàn)及分析方法：

1. 高通量測序

1. 構(gòu)建DNA和RNA文庫。

2. 制備MZ-γ氨基丁酸-018和匹配的PBMC的全基因組測序的NGS文庫。

3. 使用Illumina TruSeq PE集群套件的v3-cBot-HS對(duì)DNA和RNA末端進(jìn)行測序。

2. 生物信息學(xué)和突變檢測

1. 使用Python編程語言實(shí)現(xiàn)突變相關(guān)數(shù)據(jù)的分析。

   DNA文庫>150 x 106reads，RNA文庫>75 x 106reads

2.  采用bwa將DNA讀數(shù)與參考基因組hg19進(jìn)行比對(duì)。

3. 新表位優(yōu)先排序及選擇

1. 采用基于預(yù)測的HLA I類結(jié)合進(jìn)行排序。

2. 基于MHC I和MHC II結(jié)合預(yù)測來評(píng)估靶肽的靶標(biāo)選擇板。

4. Sanger測序

1. 采用Sanger測序技術(shù)對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。

5. 體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備

1. 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄RNA的制備，并通過凝膠電泳和微流體毛細(xì)管電泳（Experion，Biorad）評(píng)估RNA的完整性。

6. 體外刺激PBMCs

1. 對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）刺激11天后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。

7. 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISpot）

1. 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行ELISpot測定之后，通過ImmunoCapture V6.3軟件進(jìn)行分析。

   將由突變的RNA或肽刺激的T細(xì)胞應(yīng)答與對(duì)照RNA（螢光素酶）電穿孔的靶細(xì)胞或未加載的靶細(xì)胞進(jìn)行比較。

8. 多聚體染色和數(shù)據(jù)分析

1. 用多聚體對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物和活-死細(xì)胞染色。

   BD LSR Fortessa SORP上獲得染色后的細(xì)胞

9. 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色

1. 對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（IL-2 MQ1-17H12，IFNγB27，所有BD和TNFαMab11 Biolegend）進(jìn)行染色。

   在BD FACS Canto II（Becton Dickinson）上獲得樣品

10. 單細(xì)胞分選

1.   采用BD FACS Aria流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）進(jìn)行新抗原特異性T細(xì)胞的分選

11. 新表位特異性TCR的克隆

1. 進(jìn)行來自單個(gè)T細(xì)胞的T細(xì)胞受體（TCR）基因的克隆。

2. 采用來自PBMC的總RNA進(jìn)行TCR-α/β深度測序。

3. 在DNA文庫中使用Typer Toolbox軟件分析測序數(shù)據(jù)。

   每個(gè)樣品的總TCR讀數(shù)：1.1×106?1.5×106reads

12. 定量RT-PCR

1. 采用實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR.

2. 采用定量SYBR Green Real-Time PCR或TaqMan基因表達(dá)測定方法制備和分析樣品

13. 免疫組織化學(xué)

1. 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)

2. 對(duì)經(jīng)過計(jì)算機(jī)斷層掃描和手動(dòng)預(yù)定義后的腫瘤采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件量化正常組織和壞死區(qū)域。

14. 患者P04中B2M損失的表征

1. 通過手動(dòng)整理MZ-γ氨基丁酸-018與整合基因組學(xué)中的外顯子比對(duì)結(jié)果來檢測B2M基因座的缺失，并定義B2M上游的刪除起始點(diǎn)。

15. 克隆HLA抗原

1. 將HLA抗原克隆到適當(dāng)?shù)捏w外轉(zhuǎn)錄（IVT）載體中。

16. RNA轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中

17. 肽

1. 使用重疊肽庫：具有11個(gè)氨基酸重疊并由15mer合成的肽，其覆蓋27mer新抗原序列（每個(gè)新抗原4個(gè)OLPs）或控制抗原序列。

18. 流式細(xì)胞術(shù)分析

1. 在BD FACSCanto II分析流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）上進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

2. 使用FlowJo軟件（Tree Star）的第十版對(duì)獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

19. 細(xì)胞毒性測定

1. 基于熒光素進(jìn)行細(xì)胞毒性測定。

2. 根據(jù)公式計(jì)算特異殺傷：

   

20. 細(xì)胞凋亡測定

1. 在37℃，5％CO2下，使用IncuCyte Zoom Live-content成像系統(tǒng)將細(xì)胞放大十倍。

2. 使用IncuCyte分析軟件分析數(shù)據(jù)，以檢測和定量每個(gè)圖像的凋亡（綠點(diǎn)）細(xì)胞。

3. 使用GraphPad Prism軟件繪制平均綠點(diǎn)數(shù)（凋亡數(shù)）。

a. 通過免疫接種廣泛動(dòng)員突變特異性免疫

 圖1 通過免疫接種廣泛動(dòng)員突變特異性免疫

①觀察到疫苗經(jīng)皮正常給入人體后，在自身樹突細(xì)胞的ELISpot測定讀數(shù)中檢測到60％預(yù)測的新表位的反應(yīng)，表明受試的13位患者中每位患者的T細(xì)胞能對(duì)抗至少三個(gè)突變位點(diǎn)。

②觀察到預(yù)先存在的針對(duì)三分之一的免疫原性新表位有弱免疫應(yīng)答，但在接種疫苗后反應(yīng)明顯增強(qiáng)，而其他三分之二為初次應(yīng)答，表明疫苗對(duì)于腫瘤免疫應(yīng)答具有刺激作用。

③觀察到免疫原性突變均勻分布在五聚體RNA的五個(gè)位置，大多數(shù)新表位在CD4 +應(yīng)答，較小的部分被CD8 +細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTLs）識(shí)別，表明了免疫原性突變位點(diǎn)缺乏位置偏倚。

④觀察到大多數(shù)新表位疫苗誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有或很少與用RNA編碼的野生型表位轉(zhuǎn)染的自體樹突狀細(xì)胞（DCs）交叉反應(yīng)。

b. 通過疫苗接種使具有中樞和效應(yīng)記憶表型的新表位特異性T細(xì)胞快速擴(kuò)增

 圖2    通過疫苗接種使得具有中樞和效應(yīng)記憶表型的新表位特異性T細(xì)胞的快速擴(kuò)增

①PBMCs的讀取不需要預(yù)先擴(kuò)增ELISpot中新表位 - RNA加載的自體樹突狀細(xì)胞，表明血液中五分之一的免疫原性突變反應(yīng)在體外無刺激作用，而在接種新表位和共有腫瘤相關(guān)自身抗原的患者中新表位應(yīng)答更強(qiáng)，可能是由于缺乏中樞免疫耐受。

②以活化誘導(dǎo)的γ干擾素-分泌為基礎(chǔ)的單細(xì)胞經(jīng)過分選得到CD8 + T細(xì)胞，經(jīng)過體外刺激與新表位 - RNA負(fù)載的自體樹突細(xì)胞經(jīng)過TCR克隆，使用肽沖擊細(xì)胞測試編碼鑒定的TCR-α/β鏈的RNA與來自健康體的CD8 + T細(xì)胞，然后進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。觀察得到的新抗原特異性TCR的頻率。在來自患者的接種疫苗前血液樣品的TCR深度測序數(shù)據(jù)中未檢測到新抗原特異性TCR序列，但在接種后的樣品中含量豐富，證實(shí)CTL是首次誘導(dǎo)產(chǎn)生的。

③通過無RNA的樹突狀細(xì)胞與染色后的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照得出T細(xì)胞不僅具有弱的PD-1+、效應(yīng)記憶表型并且還有完全功能的γ干擾素和TNFα伴隨表達(dá)對(duì)抗原的刺激。

 c.    通過疫苗接種在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的黑素瘤患者中進(jìn)行疾病控制

圖3 通過疫苗接種在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的黑素瘤患者中進(jìn)行疾病控制

①  統(tǒng)計(jì)受試患者復(fù)發(fā)、治療和無進(jìn)展的數(shù)據(jù)以及之后每月對(duì)新表位RNA疫苗接種的轉(zhuǎn)移事件的累計(jì)總和， 證明了受試患者有復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)。

② 通過比對(duì)沒有轉(zhuǎn)移事件的累積觀察時(shí)間和事件發(fā)生月數(shù)的Fisher精確檢驗(yàn)，和目標(biāo)病變的計(jì)算機(jī)斷層掃描以及ELISpot對(duì)P07的疫苗誘導(dǎo)的體外反應(yīng)，表明新表位疫苗接種前后所有患者的黑色素瘤復(fù)發(fā)顯示縱向累積復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移事件（P <>

③ 觀察到P17患者的疫苗誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)，表明疫苗激發(fā)了腫瘤免疫應(yīng)答。

d.    新表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)與P04中B2M缺陷黑素瘤細(xì)胞的生長免疫逃逸相關(guān)。

圖4 新表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)與P04中B2M缺陷黑素瘤細(xì)胞的生長免疫逃逸相關(guān)

①  針對(duì)HLA多聚體檢測接種后病變的血液，和TIL中的兩個(gè)新表位的CD8 + T細(xì)胞的頻率，在不同條件下HLA刪除和倒置使得基因組映射而導(dǎo)致B2M丟失。通過熒光素酶細(xì)胞毒性測定來測量新表位的TCR，最后轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移黑素瘤細(xì)胞的B2M。在12例應(yīng)用后，切除殘留的轉(zhuǎn)移灶，病理診斷幾乎完全壞死，與預(yù)接種黑素瘤標(biāo)本相比：CD8 + T細(xì)胞浸潤、PD-L1染色、免疫激活和炎癥標(biāo)記物的表達(dá)均增加。

由于黑色素瘤具有多基因突變的性質(zhì)，選用黑色素瘤作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象讓科學(xué)家有充足的機(jī)會(huì)選擇合適的抗原。在13位接種疫苗的患者中，8人腫瘤完全消失且23個(gè)月內(nèi)無復(fù)發(fā)，其余5名患者由于接種疫苗時(shí)腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散，有2人出現(xiàn)腫瘤縮小，其中1人接受輔助治療后腫瘤完全消退，證明了基于突變組學(xué)的個(gè)性化RNA疫苗的臨床可行性、安全性和抗腫瘤活性。免疫治療發(fā)揮了精準(zhǔn)醫(yī)療的極致但是仍面臨挑戰(zhàn)——每個(gè)腫瘤都有獨(dú)特的“指紋”，要研制出個(gè)性化的疫苗需要投入大量的時(shí)間與精力。

參考文獻(xiàn)：

[1] Carmen Loquai, ?zlem Türeci,et al.[J].Nature, 2017, 547: 222-226.