使用10X 建庫方法和作者開發(fā)的SV分析方法，相比短序列測序能有效檢測基因組中復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異，對癌癥中染色體結(jié)構(gòu)變異難以檢測的問題提供了解決方案。

SV包括DNA的缺失、重復(fù)、倒位和易位。由于每種SV都會(huì)影響大范圍的基因組區(qū)域，代表了不同個(gè)體和癌癥基因組中的大部分差異核苷酸，這使得SV在進(jìn)化和疾病方面重要性不言而喻。然而現(xiàn)有的二代短序列數(shù)據(jù)只能找到斷點(diǎn)距離小于片段大?。ㄍǔ?00bp）的非常有限的SV數(shù)目，長距離的SV重建需要能檢測到同一單倍體的長序列，三代的單分子測序雖然滿足這一要求，但其高錯(cuò)誤率、低通量和高成本使其應(yīng)用受限。

建庫時(shí)使用微流體技術(shù)包裹長基因組片段，將每個(gè)液滴中長片段打斷的短序列用同一條碼（barcode）標(biāo)記，從而保留長序列信息。這樣擁有相同barcode的一組短序列稱為“序列云”。利用10X方法建庫，得到擁有相同barcode（即來自同一長序列）的短序列云 ，理論上可以被用于識別、組裝、和重建大范圍復(fù)雜SV，且組合二代測序方法較三代經(jīng)濟(jì)許多。應(yīng)用為此開發(fā)的新方法GROC-SVs，作者研究了肉瘤細(xì)胞系中的染色體碎裂和隨后的SV進(jìn)化過程。發(fā)現(xiàn)比起傳統(tǒng)二代短序列測序，斷點(diǎn)檢測的敏感性大有提高。結(jié)果還表明染色體的重排發(fā)生在拷貝數(shù)擴(kuò)增之前，單核苷酸變異（SNV）和結(jié)構(gòu)變異（SV）并無直接關(guān)系。

分析步驟

10X Genomic長片段文庫構(gòu)建及Illumina測序---斷點(diǎn)檢測---斷點(diǎn)序列組裝---對SV進(jìn)行單倍體定相---復(fù)雜事件的全基因組重建---后處理---與短序列方法的驗(yàn)證和比較---進(jìn)化分析。 

樣本來源

從斯坦福組織庫取得來自同一肉瘤塊的7個(gè)不同部位的小塊作為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)記為0、1、2、3、6、9、10，其對照樣本取自同一病人的腎組織。對所有樣本進(jìn)行基于10X和標(biāo)準(zhǔn)短序列方法的測序以進(jìn)行比較。其中短序列方法建庫使用PCR-free方案，可用以精確檢測拷貝數(shù)變異。在進(jìn)化分析中，肉瘤的祖先（起源）樣本來自其他研究。 

GROC-SVs分析原理

簡單來說，GROC-SVs分析主要分為兩個(gè)過程：第一步，將序列云比對回基因組后，對每個(gè)位點(diǎn)和其他位點(diǎn)的barcode相似性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)定量，并畫出類似圖1a最右邊的斷點(diǎn)圖。同一位置由于覆蓋barcode相似或相同，會(huì)形成圖中的對角線（Diagonal）。而兩個(gè)相差很遠(yuǎn)的位置斷點(diǎn)融合后，由于相同的barcode覆蓋，便會(huì)形成斷點(diǎn)圖對角線以外的散點(diǎn)（Translocation），對每個(gè)位置遍歷這一過程，GROC-SVs就獲得了具有關(guān)聯(lián)性的多個(gè)斷點(diǎn)位置（多個(gè)也說明了SV形成的復(fù)雜性）。第二步，抓取這些斷點(diǎn)位置上的序列，并通過重疊的序列信息得到斷點(diǎn)的先后排列順序，據(jù)此將這些序列組裝起來。最后根據(jù)組裝結(jié)果重建出復(fù)雜SV事件的進(jìn)化圖，如圖1b。

      圖1 GROC-SVs原理示意

圖2展示了第一步的實(shí)際操作過程，斷點(diǎn)處barcode覆蓋了chr1、chr2兩處位置，在坐標(biāo)系上會(huì)通過畫長方形來表示每條barcode的在這兩處位置的相似性。比如用紅色表示的這條序列，在chr1中片段長，chr2覆蓋片段短，那么坐標(biāo)系中長方形在chr1（x軸）的長度就長，在chr2（y軸）長度就短。將這些斷點(diǎn)處序列通過長方形的不同的長寬轉(zhuǎn)換到坐標(biāo)系后，相比起背景顏色，就會(huì)形成一個(gè)三角形的高亮區(qū)。實(shí)際圖（圖3）也展示在了下方，左為肉瘤樣本中的斷點(diǎn)，右為同一位置的正常樣本。

圖2 barcode相似性直方圖的說明 

圖3  肉瘤樣本0中的簡單斷點(diǎn)

1.復(fù)雜事件重構(gòu)

圖4 a-c顯示了復(fù)雜事件是如何重建的。圖4a展示了6個(gè)擁有相似序列云的連續(xù)斷點(diǎn)，圖4b則是這些斷點(diǎn)相應(yīng)的拷貝數(shù)圖譜，通過方法中對這些斷點(diǎn)位置的排列信息而重構(gòu)復(fù)雜事件。不同斷點(diǎn)對應(yīng)的每一行代表一個(gè)云，橙色代表成功分配到確定的單倍體上，黑色代表未分配成功。在非染色體碎裂的細(xì)胞系（HCC1143）中，共檢測到24個(gè)斷點(diǎn)，重建出11個(gè)復(fù)雜事件，包括一個(gè)非常大的倒置重復(fù)（圖4 d-f）。這說明序列云在檢測復(fù)雜結(jié)構(gòu)變異的強(qiáng)大能力。

圖4 乳腺癌中的復(fù)雜事件重構(gòu)

 2.全基因組的SV發(fā)現(xiàn)，比較和驗(yàn)證

肉瘤基因組擁有大量的結(jié)構(gòu)變異，總共檢測出503個(gè)體細(xì)胞斷點(diǎn)。從circos圖（圖5a）上可看出12號染色體變異密度很高，具有174個(gè)斷點(diǎn)。circos圖最外層代表染色體，其中綠線是指著絲粒位置；往內(nèi)是拷貝數(shù)柱狀圖；最內(nèi)層是拷貝異常示意，紅色代表缺失，藍(lán)色代表擴(kuò)增。洋紅色弧線代表染色體內(nèi)變異事件，藍(lán)色弧線代表染色體間變異。其中a代表祖先樣本中414個(gè)復(fù)雜事件，而b、c分別代表0、10號樣本特有的復(fù)雜事件。從圖中可以看出不同染色體間有大量的SV事件發(fā)生。

10X數(shù)據(jù)檢測的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于與標(biāo)準(zhǔn)短序列SV檢測方法相比，它的高物理覆蓋顯著提高信噪比。支持SV的10X片段數(shù)量與序列云配對片段數(shù)目高度相關(guān)，從中位數(shù)上說，是短序列方法的3.2倍。對于成功組裝的SV斷點(diǎn)序列來說，驗(yàn)證成功率高達(dá)98.6%。而短序列方法中，驗(yàn)證率只有65.1%。

圖5 全基因組SV的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)化分析

3.肉瘤中的基因組進(jìn)化

圖5d顯示了用高置信的SNV位點(diǎn)重建的樣本的進(jìn)化樹。粗斜體表示斷點(diǎn)數(shù)量，正小字表示每個(gè)分支的SNV數(shù)量。每個(gè)樣本按照體細(xì)胞等位基因頻率細(xì)分為亞克?。ㄩL方形中陰影）。所有肉瘤樣本中都出現(xiàn)但未在對照組中發(fā)現(xiàn)的414個(gè)斷點(diǎn)與共同祖先a中414個(gè)一致。并發(fā)現(xiàn)祖先樣本重排后擁有高度擴(kuò)增的典型脂肪肉瘤驅(qū)動(dòng)基因，MDM2。作者確定了幾個(gè)肉瘤樣本中的特有的89個(gè)SV突變，發(fā)現(xiàn)大部分位于5、7、12號染色體，10號樣本中59個(gè)、0號樣本中11個(gè)、3號樣本中3個(gè)的標(biāo)記子克隆SV沒有在其他樣本中發(fā)現(xiàn)。

圖5e顯示了SV和SNV在進(jìn)化樹分支間的數(shù)量對比。圖中虛線表示祖先分支在恒定速率模型下，SV相對于SNV的積累速率。從圖中表明，SV不是按照細(xì)胞分裂數(shù)量成比例積累的，而是在進(jìn)化過程中以爆發(fā)形式聚集，否則圖中的點(diǎn)應(yīng)排列于虛線附近（SNV與數(shù)目與分裂數(shù)量成比例）。從樣本10的SNV和SV數(shù)目可看出，SV數(shù)目和SNV數(shù)目沒有一致性，這表明SV積累是偶然的。從圖3a-c可以發(fā)現(xiàn)，祖先樣本中只有30%的染色體間SV變異集中于5、7號染色體間，而b中0號樣本幾乎全部富集于5、7號上。這進(jìn)一步說明SV是爆發(fā)于一個(gè)足夠短的時(shí)間，以至于SNV未積累到足夠水平來觀察到亞克隆。

10X Genomics建庫方法組合二代測序是一種經(jīng)濟(jì)有效的單分子長序列測序方法。本文作者開發(fā)了稱為GROC-SVs的基因組結(jié)構(gòu)變異分析方法，并將其應(yīng)用于10X Genomics 和Iluumina二代測序組合產(chǎn)生的肉瘤數(shù)據(jù)中，取得了良好結(jié)果?，F(xiàn)在的全基因組復(fù)雜SV重建總限制于斷點(diǎn)距離無法不長于插入片段大?。?00bp），而作者結(jié)果顯示約40%的斷點(diǎn)之間距離大于10kb。這也證明了序列云方法的適用性。從進(jìn)化分析結(jié)果來看，除了祖先樣本中的SV外，7個(gè)樣本大部分的SV都不一樣，這說明SV必須發(fā)生在腫瘤進(jìn)化的早期。值得注意的是，10號樣本中SNV為0，而SV數(shù)目較多說明，SV可能由于基因組不穩(wěn)定性的爆發(fā)。

使用10X 和 GROC-SVs方法預(yù)計(jì)未來能在結(jié)構(gòu)變異的檢測中取得重要進(jìn)展。相比起二代短序列測序在檢測SV的準(zhǔn)確性和靈敏度上均有很大提高。從文中的分析可以預(yù)見，這種策略對了解腫瘤間結(jié)構(gòu)進(jìn)化及復(fù)雜變異的重建將取得重大進(jìn)展。雖然二代測序較三代價(jià)格上優(yōu)勢明顯，但10X建庫費(fèi)用仍不便宜。未來大規(guī)模的全基因組SV精確檢測依然有賴于建庫費(fèi)用的下降，這一天相信會(huì)早日到來。