1.從10389例患者（來源于33個癌種）中檢出了871個易感型變異和CNV；

2.泛癌癥研究鑒定了跨癌癥共同的變異基因；

3. 33個影響致癌基因激活結(jié)構(gòu)域的變異表達(dá)量較高；

4.使用了癌癥富集，雜合性缺失(LOH)，表達(dá)和其他證據(jù)優(yōu)化出47個VUSs ( variants relegated to the uncertainsignificance)。

相當(dāng)一部分的癌癥是可遺傳的，但是已知的常見變異只能解釋癌癥的一部分遺傳負(fù)荷。100多個基因（其中大部分是抑癌基因）擁有罕見的易感型等位基因。雖然越來越多的證據(jù)表明許多癌癥有著共同的易感因子，但是大多數(shù)報道的胚系變異都集中在單一的癌癥類型。先前的泛癌癥研究闡明了這些抑癌基因的致病胚系變異，包括TCGA和COGS中的ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、PALB2基因，PCGP中的TP53,APC,BRCA2,NF1,PMS2,RB1基因。隨著測序項目的擴(kuò)大，對多基因范疇和多癌癥型別的大范圍系統(tǒng)分析是急需的。對胚系變異的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行的系統(tǒng)分析，像腫瘤測序數(shù)據(jù)和mRNA測序數(shù)據(jù)，這些可以提供功能實驗的證據(jù)，也便于深層次的臨床解釋。諸如腫瘤和正常樣品的測序數(shù)據(jù)中等位基因信息可以驗證抑癌基因的變異在經(jīng)典的二次打擊理論模型下是否經(jīng)歷了正向選擇，mRNA分析則可以給出胚系截斷突變是否導(dǎo)致表達(dá)減少的證據(jù)。值得注意的是，現(xiàn)在的的ACMG-AMP指南沒有使用這種類型的體細(xì)胞分析證據(jù)作為胚系變異有害性評價的證據(jù)。

本文研究中，作者分析了TCGA中33個癌種共計10389例樣本的致病性變異的圖譜，發(fā)現(xiàn)致病胚系變異或疑似胚系變異占比8%，在致癌基因中鑒定了33個變異，然后通過在其他癌種群體的驗證和RET等位基因的實驗，調(diào)查了這些變異的功能性后果。最后，又發(fā)現(xiàn)了18個拷貝數(shù)缺失和47個基于多條功能性證據(jù)的VUSs?？傊狙芯砍尸F(xiàn)了關(guān)于罕見的胚系易感變異的最大系統(tǒng)性分析的結(jié)果，也提供了解決癌癥功能性問題的強(qiáng)大基礎(chǔ)支持。

跨33個癌種的致病變異發(fā)現(xiàn)

作者開發(fā)了一個名稱為CharGer的變異自動分類流程，它采用并擴(kuò)展了ACMG-AMP指南，專門用于癌癥的罕見變異。CharGer評估每一個變異后，如果是Clinvar和自建數(shù)據(jù)庫中已知的致病變異會將其標(biāo)記為致病，反之則將CharGer得分大于8的變異記為疑似致病，得分大于4的記為優(yōu)先VUSs(圖s2)。使用PCGP庫的883個胚系變異對這個自動分類流程基準(zhǔn)評價，證明了它的高性能：敏感性88%，假陽性率4.9%。使用CharGer對TCGA群體中的變異進(jìn)行分類，31963個變異中1393個記為癌癥中的罕見變異（1000人基因組和全ExAC r.3.0.1中等位基因頻率<=0.05%>

4.1%(n=428)的個體中檢出致病變異，另外3.8%（n=390）的個體攜帶疑似致病變異（圖2A）。不同的癌癥類型致病或疑似致病變異檢出的頻率極為不同,OV中檢出19.9%，BRCA中為9.9%。其他的癌癥類型和組織相關(guān)，涉及到環(huán)境暴露因子的有著較低的攜帶檢出率，比如SKCM(6.2%)和UVM（5%）。在PCPG中22.9%，PAAD中14.1%，SARG中12.5%的檢出表明罕見胚系變異在這些癌癥人群中有著較多的分布。

作者也研究了致病變異/疑似致病變異和癌癥類型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)28個特異的癌癥-基因關(guān)系（FDR<><><>

圖2 跨基因癌癥類型的致病胚系變異分布

變異攜帶者基因表達(dá)產(chǎn)量的改變

致癌基因的表達(dá)量與抑癌基因相比分布明顯不同（圖4B），抑癌基因的致病/疑似致病變異胚系變異相對有著較低的基因表達(dá)量。抑癌基因的47.6%變異位于表達(dá)量的底部1/4，致癌基因的62.1%位于表達(dá)量的頂部1/4，這表明攜帶致病/疑似致病變異的致癌基因和抑癌基因有著大相徑庭的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。在變異水平，有METp.H1112R變異的三種腫瘤都在KIRP的頂部的25%。12例攜帶易感RET等位基因的個體在他們各自的癌種群體中有著較高的RET表達(dá)量。兩個乳腺癌PTPN11攜帶者p.N58S和p.T411M都有著較高的表達(dá)量(>88%)。腫瘤中高表達(dá)的變異相關(guān)致癌基因，許多都沒有檢出拷貝數(shù)擴(kuò)增，暗示癌癥細(xì)胞傾向上調(diào)致癌基因的致病等位基因。

圖 4B 胚系變異基因

罕見的胚系拷貝數(shù)改變

對SNP芯片數(shù)據(jù)和外顯子數(shù)據(jù)分析，分別發(fā)現(xiàn)42208和53726個罕見的CNVs(圖5A)。頻率過濾后得到3584個重疊的CNVs?？傮w而言，每個個體有0.38個重疊的缺失，0.96個重疊的重復(fù)。44%的CNV影響一個基因，56%的CNV影響多個基因（圖5B）。基于大量發(fā)現(xiàn)的CNVs，作者假設(shè)致病的CNVs位于特定癌癥富集的基因上。使用28個癌癥-基因關(guān)聯(lián)對，發(fā)現(xiàn)11個抑癌基因中明顯拷貝數(shù)缺失的18次事件（圖5C）。驗證特異腫瘤中CNVs缺失的轉(zhuǎn)錄效果顯示：9/14的個體顯示在他們各自的癌癥中有明顯的較低表達(dá)，其他受累樣品沒有此種情況。

圖5罕見胚系拷貝數(shù)變異

獨(dú)立的致病性基因組支持證據(jù)

作者尋找了853個致病/疑似致病變異可以致病的獨(dú)立證據(jù)：（1）單個變異水平，癌癥個體相比非癌癥個體的顯著富集程度；（2）變異與兒科癌癥中致病胚系等位基因共定位，或者是周期性體系突變；（3）與轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)的共定位。為了確定致病/疑似致病變異是否富集于癌癥病例中，作者通過比較TCGA 病例中的等位基因頻率與非TCGA的個體進(jìn)行了關(guān)聯(lián)測試，發(fā)現(xiàn)了30個暗示關(guān)聯(lián)性的獨(dú)特變異（圖6A），TOP4是ATM的p.E1978*，BRCA1的p.Q1777fs,POT1的p.R363*,PALB2的p.R170fs。同時，這些結(jié)果也為致癌基因變異MET p.H1112R和MPL p.F126fs提供了證據(jù)。在TCGA隊列中，觀察到先前在1,120種兒科癌癥中發(fā)現(xiàn)的28種致病/可能致病變異，包括BRIP1，ERCC3，F(xiàn)ANCC，MSH2和WRN中的獲得終止密碼子變異。而且，發(fā)現(xiàn)23個胚系變異和頻發(fā)的體細(xì)胞突變共定位于TCGAMC3人群中（圖6B）。比如TP53 p.R248W是高度復(fù)發(fā)的體細(xì)胞突變，同時被觀察為小兒橫紋肌肉瘤和LGG的胚系變異；MEN2（多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤2型）相關(guān)等位基因RET p.M918T也檢出于 PCPG，并與MEN2B疾病相關(guān)也被發(fā)現(xiàn)是復(fù)發(fā)體細(xì)胞突變。這些暗示了兒科癌癥和成人癌癥共享著同樣的致癌過程，就和胚系基因組和體細(xì)胞基因組一樣。進(jìn)一步評估這組853例致病/疑似致病變異是否可以影響更廣泛的患病人群：作者對德克薩斯州大學(xué)的MDACC研究所收集的腫瘤群體進(jìn)行了重疊性研究，在MDACC的8種腫瘤類型人群中重新發(fā)現(xiàn)了TCGA中發(fā)現(xiàn)的29個特異性變異(0.96%突變攜帶頻率)，作為比較，在來源于ExAC人群的非TCGA樣品中只發(fā)現(xiàn)0.58%的變異攜帶率（53105個樣本），這表明這些變異富集于癌癥中。

圖 6 致病變異功能支持性獨(dú)立證據(jù)

轉(zhuǎn)錄后修飾位置的變異

對853個變異和ActiveDriverDB/ PhosphoSitePlus/UniProt Knowledge Base的316216個已知轉(zhuǎn)錄后修飾變異進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)65個錯義變異和34個獨(dú)特的PTMs重合或相近。和致病PTM（post-translationalmodification）相關(guān)的前6個基因包括VHL,CHEK2,BUB1B,TP53,RET。這和我們之前發(fā)現(xiàn)的PTMs位點(diǎn)富集于疾病突變是一致的。對PTM變異和位點(diǎn)特異的酶底物反應(yīng)匹配研究表明60%以上發(fā)生在已知蛋白位點(diǎn)的9/18個基因的獨(dú)特取代邊界都是上游激酶或者其他類型的酶。這都表明一系列的致病易感胚系變異都是通過擾亂或重組復(fù)雜的蛋白信號網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮功能。

組合證據(jù)判定VUSs

用于判定VUSs的整合途徑分析可以聯(lián)系到潛在的功能性，在540個優(yōu)先的VUSs中，作者發(fā)現(xiàn)了47個額外的易感變異，然而需要至少以下的2類證據(jù)：案例-對照頻率，LOH,表達(dá)效果，和頻發(fā)突變/PTMs的共定位情況（圖S2）。這些功能評價的方法在未來變異分類中可能會更廣為人知。

一般而言，胚系變異經(jīng)常由于在現(xiàn)行可用數(shù)據(jù)庫中缺乏證據(jù)，在ACMG-AMP分類系統(tǒng)缺少體細(xì)胞突變信息兩類原因在分類系統(tǒng)中被忽視。文章所用的方法證明腫瘤和正常組織匹配的測序?qū)τ谂呦底儺惖慕忉尩挠杏眯?，因為它們需要二次打擊事件，包括LOH和二等位基因事件。在每一個癌癥患者個體中，檢出34%和4.3%的致病/疑似致病胚系變異發(fā)生了LOH和二等位基因事件。在群體水平，發(fā)現(xiàn)胚系變異和體細(xì)胞突變影響相同的基團(tuán)。盡管以上的方法提供了對于胚系變異的系統(tǒng)評價，但是謹(jǐn)慎的評價要求去除復(fù)雜因子的影響，如可能誘導(dǎo)LOH的乘客體細(xì)胞拷貝數(shù)事件。這些信息幫助驗證了多效基因變異的致癌效應(yīng)。RNA-seq的腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)表明近半數(shù)抑癌基因的變異有著較低的基因表達(dá)，突出了體細(xì)胞突變影響功能基因的潛力，也可能驗證了胚系變異的轉(zhuǎn)錄效果。胚系變異與PTMs的重合顯示了信號作為癌癥一種可能的易感機(jī)制。除了2個已知的與PTMs重合的致病變異（TP53和PTEN）和其他接近PTMs的變異，選擇優(yōu)先的VUSs也顯示了調(diào)整PTMs的重要性。總之，文章系統(tǒng)核實超過1萬個樣本的易感變異和相應(yīng)的功能證據(jù)。33個癌癥類別中致病變異的分類告訴我們癌癥的基因遺傳學(xué)知識。而且，這些結(jié)果表明每一個胚系變異都應(yīng)該在相應(yīng)體細(xì)胞基因組和下游表達(dá)的背景下謹(jǐn)慎評價。這些證據(jù)不僅有助于驗證致病變異，并且有利于對VUSs的優(yōu)先排級和對非編碼基因組的發(fā)現(xiàn)。

本文利用TCGA數(shù)據(jù)庫的上萬例樣本進(jìn)行了多癌種的胚系致病變異分析，因為數(shù)據(jù)量較大，所以其中使用的研究分析方法和得到的結(jié)論值得我們借鑒。首先，對癌癥胚系變異的致病性評價所使用的ACMG-AMP，文章專門進(jìn)行了一些針對性擴(kuò)展，并相應(yīng)添加了一些獨(dú)立的致病性支持證據(jù)如致病變異與頻發(fā)體細(xì)胞突變共定位等。令人佩服的是作者還特異開發(fā)了變異分類的CharGer流程。其次，進(jìn)行一些統(tǒng)計分析時，公共人群數(shù)據(jù)庫資源的使用也是恰到好處的。當(dāng)然，大數(shù)據(jù)泛癌癥分析中的一些發(fā)現(xiàn)也很讓人驚訝。

參考文獻(xiàn)：

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