背景介紹

DNA甲基化是基因組表觀遺傳修飾的重要組成部分，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、個(gè)體發(fā)育等方面起重要作用。DNA甲基化水平的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

基因組甲基化模式的建立和維持由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)完成。其中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）是從頭甲基化的兩種甲基轉(zhuǎn)移酶之一，通過(guò)控制基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)水平。DNMT3A可以與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶以及microRNA作用，協(xié)同完成對(duì)腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控，是近年來(lái)腫瘤表觀遺傳機(jī)制研究的重要分子。

已有的研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因突變可見(jiàn)于多種血液系統(tǒng)腫瘤，尤其在急性髓系白血病中發(fā)生頻率較高，并提示不良預(yù)后。在實(shí)體瘤中，雖然DNMT3A已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)異常，但其臨床意義及具體的功能機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。

現(xiàn)有的報(bào)道DNMT3A含有至少兩個(gè)異構(gòu)體，DNMT3Aa（全長(zhǎng)蛋白，由基因DNMT3Aa編碼）以及DNMT3Ab（較短的異構(gòu)體，由位于DNMT3Aa第六個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄）。其中DNMT3Ab是胚胎干細(xì)胞、胚胎性癌細(xì)胞中主要表達(dá)的異構(gòu)體。

文章概括

在這篇文章中，研究人員報(bào)道了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的異構(gòu)體DNMT3Ab，對(duì)于胃癌中上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換（EMT）過(guò)程及腫瘤轉(zhuǎn)移非常重要。

在這篇文章中，研究者通過(guò)對(duì)胃癌樣本的分析、以及體內(nèi)外的功能學(xué)研究，證明了DNMT3Ab可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移以及侵襲能力，對(duì)胃癌的轉(zhuǎn)移非常重要。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab被招募到E-cadherin的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控該區(qū)域的DNA甲基化，并與H3K9me2和H3K27me3修飾協(xié)同作用，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，并且這一過(guò)程依賴于轉(zhuǎn)錄因子Snail。研究者的發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)DNMT3A及其異構(gòu)體在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用的了解，從表觀遺傳調(diào)控的角度為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。

DNMT3Ab調(diào)控胃癌EMT過(guò)程模式圖

研究結(jié)果

1. DNMT3Ab在胃癌中過(guò)表達(dá)并具有臨床重要性

研究者首先運(yùn)用免疫印跡法檢測(cè)了胃癌樣本中DNMT3Aa和DNMT3Ab的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比， DNMT3Aa和DNMT3Ab在腫瘤組織中顯著過(guò)量表達(dá)（圖1a-1c），并且DNMT3Aa與DNMT3Ab的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（圖1d），提示DNMT3Aa、DNMT3Ab在胃癌中可能具有不同的生物學(xué)功能。

進(jìn)一步的臨床病理相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab的過(guò)量表達(dá)與TNM分期、陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目增多相關(guān)；而DNMT3Aa過(guò)表達(dá)則與腫瘤細(xì)胞分化和血管侵襲相關(guān)（表1）。在原位腫瘤組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移伴隨DNMT3Ab高表達(dá)，而DNMT3Aa表達(dá)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒(méi)有相關(guān)性（圖1e，1f），提示DNMT3Ab可能對(duì)胃癌患者的轉(zhuǎn)移具有重要性。

此外，研究者對(duì)130例胃癌樣本進(jìn)行IHC染色，發(fā)現(xiàn)DNMT3Aa主要位于細(xì)胞核，而DNMT3Ab在全細(xì)胞彌散表達(dá)（圖1g）。且DNMT3Ab表達(dá)量越高，預(yù)后越不良，是影響患者生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子（圖1h）。

圖1. 胃癌組織中DNMT3Ab過(guò)量表達(dá)

表1. DNMT3Ab表達(dá)量與胃癌腫瘤組織的臨床病理相關(guān)性分析

2. DNMT3Ab促進(jìn)胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

在細(xì)胞層面，研究者發(fā)現(xiàn)與胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1相比，DNMT3Ab在胃癌細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)。研究者在轉(zhuǎn)移能力較弱的MKN45、BGC-823胃癌細(xì)胞株中構(gòu)建了DNMT3Ab的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)株，在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的MKN28細(xì)胞株中構(gòu)建了DNMT3Ab穩(wěn)定敲低細(xì)胞株，進(jìn)而在體內(nèi)、體外檢測(cè)DNMT3Ab對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。

體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab顯著增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而不影響細(xì)胞增殖（圖2a, 2b）；與之相反，敲低DNMT3Ab則導(dǎo)致細(xì)胞的遷移、侵襲能力顯著減弱（圖2c）。

體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，尾靜脈注射過(guò)表達(dá)DNMT3Ab胃癌細(xì)胞的裸鼠胃癌肺轉(zhuǎn)移增加，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目也增加（圖2d, 2e）。通過(guò)IHC染色，發(fā)現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移病灶中DNMT3Ab表達(dá)量上升（圖2f）。

圖2. DNMT3Ab增強(qiáng)胃癌細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力

3. DNMT3Ab過(guò)表達(dá)引起上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換EMT

研究者觀察到過(guò)表達(dá)DNMT3Ab的胃癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從單層上皮樣細(xì)胞變?yōu)樗笮蔚睦w維細(xì)胞樣形態(tài)，提示細(xì)胞可能發(fā)生了EMT過(guò)程；而過(guò)表達(dá)DNMT3Aa則不引起細(xì)胞形態(tài)變化（圖3a）。與表型一致，在分子層面，免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab的細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin、β-catenin表達(dá)量降低，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin、N-cadherin表達(dá)量上升；而DNMT3Aa則不改變標(biāo)志物的表達(dá)量（圖3b）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)量降低，Vimentin表達(dá)量升高，同時(shí)F-catin染色結(jié)果提示細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重排（圖3c）。這些結(jié)果提示DNMT3Ab可能是通過(guò)引起EMT促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的侵襲能力。

圖3. DNMT3Ab引起EMT過(guò)程

4. DNMT3Ab調(diào)控E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化，抑制E-cadherin轉(zhuǎn)錄

EMT的標(biāo)志之一是E-cadherin的功能丟失，而之前的研究報(bào)道DNA甲基化對(duì)E-cadherin的抑制與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。

通過(guò)定量甲基化特異性PCR（Q-MSP）檢測(cè)，研究者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab引起E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平上升；而敲低DNMT3Ab引起甲基化水平下降（圖4a-4c）。焦磷酸測(cè)序技術(shù)也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab后E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化發(fā)生頻率顯著上升（圖4d）。同時(shí)，ChIP實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)DNMT3Ab時(shí)E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的DNMT3Ab結(jié)合增加（圖4e）。

同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab過(guò)表達(dá)細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)量下降，DNMT3Ab敲低細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)量增加（圖4f, 4g）；而過(guò)表達(dá)或敲低DNMT3Aa則不能影響細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)水平（圖4h）。

此外，研究者比較了24例胃癌樣本，發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而DNMT3Aa與E-cadherin的表達(dá)之間則沒(méi)有相關(guān)性（圖4i）。

圖4. DNMT3Ab抑制E-cadherin表達(dá)

5. 抑制DNMT3Ab削弱了胃癌細(xì)胞的EMT及轉(zhuǎn)移

DNMT3Ab抑制E-cadherin的表達(dá)，那么DNMT3Ab是否在胃癌細(xì)胞的EMT過(guò)程中發(fā)揮作用呢？研究者首先用TGF-β處理胃癌細(xì)胞，獲得了間充質(zhì)表型、及與之相符的分子marker變化，同時(shí)觀察到DNMT3Ab、及EMT相關(guān)因子Snail的表達(dá)水平上調(diào)（圖5a, 5b）；并且這種由TGF-β所引起的EMT過(guò)程在siRNA抑制DNMT3Ab表達(dá)后被抑制（圖5c），伴隨E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化修飾的減少及E-cadherin表達(dá)量的上調(diào)（圖5d, 5e）。進(jìn)一步的ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)TGF-β處理的胃癌細(xì)胞中抑制DNMT3Ab表達(dá)后，E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集降低（圖5f）。

此外，體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，尾靜脈注射DNMT3Ab敲低胃癌細(xì)胞的裸鼠發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率降低（圖5g）。

圖5. DNMT3Ab的沉默抑制了EMT過(guò)程及胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

6. DNMT3Ab對(duì)E-cadherin的調(diào)控依賴于Snail

為了研究DNMT3Ab與Snail在調(diào)控E-cadherin中的關(guān)系，研究者進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DNMT3Ab與Snail直接相互作用，而DNMT3Aa則不能（圖6a），并且在DNMT3Ab過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，Snail在E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合增加。

在DNMT3Ab過(guò)表達(dá)細(xì)胞中用siRNA抑制Snail表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)量上調(diào)，E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化下降，并且E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)域DNMT3Ab、H3K9me2、H3K27me3的富集顯著減少（圖6b-6d）。同時(shí)，表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞在DNMT3Ab過(guò)表達(dá)后增強(qiáng)的的轉(zhuǎn)移和侵襲能力在抑制Snail后顯著減弱（圖6e, 6f）。

圖6. DNMT3Ab對(duì)E-cadherin的抑制依賴于Snail

7. DNMT3Ab改變了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)譜

為了研究DNMT3Ab如何特異性調(diào)控胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及EMT過(guò)程，研究者分析了對(duì)照細(xì)胞及DNMT3Ab過(guò)表達(dá)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，并與前期實(shí)驗(yàn)中DNMT3Aa過(guò)表達(dá)細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，找到了317個(gè)表達(dá)受到DNMT3Ab特異性調(diào)控的基因（圖7a）。通過(guò)GO分析，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DNMT3Ab主要影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和TGF-β信號(hào)通路（圖7b, 7c）；這其中一系列與腫瘤細(xì)胞侵襲、EMT過(guò)程相關(guān)的基因如CLDN7、MMP7、FN1等表達(dá)發(fā)生改變，qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證了這些變化（圖7d, 7e），提示DNMT3Ab通過(guò)調(diào)控多個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的能力進(jìn)行調(diào)控。

圖7. DNMT3Ab調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)水平

討論

DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞癌變有著密切的聯(lián)系。胃癌是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。而DNMT家族蛋白在胃癌中的作用還不十分清楚。這篇文章中，研究者從臨床樣本出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了DNMT3Ab在胃癌組織中的過(guò)量表達(dá)，并通過(guò)進(jìn)一步的體內(nèi)外的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，闡明了DNMT3Ab在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要調(diào)控作用，及其調(diào)控機(jī)制。研究者的工作為表觀遺傳修飾如何精細(xì)調(diào)控胃癌的轉(zhuǎn)移提供了更多的證據(jù)， DNMT3Ab/Snail/E-cadherin信號(hào)軸可能為伴隨DNMT3Ab高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性胃癌提供了新的治療策略。

原文鏈接：

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