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腫瘤中的轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳調(diào)控的作用早已被大眾所知，特別是BET家族的BRD4蛋白，能夠識別組蛋白乙?；?，啟動一系列基因表達(dá)，其中就包括了關(guān)鍵性的原癌基因，MYC轉(zhuǎn)錄因子（1）。基于此，BET抑制劑（BETi）也是研究和臨床實驗中著名的小分子，通過抑制BET蛋白的活性抑制MYC為代表的一系列關(guān)鍵下游基因表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤的作用。而MYC轉(zhuǎn)錄因子本身就是最重要的原癌基因之一，已經(jīng)有許多報道能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞基本代謝，影響細(xì)胞生存（2）。 然而無論是BRD4、還是MYC等腫瘤關(guān)鍵基因，由于功能水平上相互需要、相互影響，以及研究手段無法區(qū)分等，導(dǎo)致了之前的研究中對于每個關(guān)鍵性腫瘤相關(guān)基因直接的調(diào)控下游及其功能并不清晰。本研究利用新的手段SLAM-seq，分別分析了BRD4和MYC這兩個蛋白調(diào)控的下游基因及其機(jī)理，指出BRD4作為組蛋白乙?；痳eader通過調(diào)節(jié)Pol2磷酸化影響幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄；而MYC作為轉(zhuǎn)錄因子只能特異性的結(jié)合和調(diào)節(jié)自身下游基因，這一調(diào)控的Axis的兩個關(guān)鍵蛋白在不同層面上發(fā)揮各自的作用。 LAM-seq，即Thiol(SH)–linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA，通過向合成中的mRNA鏈中摻入4-thiouridine (4sU)，使得原本的堿基T被4sU修飾，從而在反轉(zhuǎn)錄中被錯認(rèn)為C，導(dǎo)致原本應(yīng)該為堿基A的位置錯配成為G。然后測序過程中通過分析這些錯配的G，就可以得到新合成mRNA的信息。 1：SLAM-seq分析BRD4功能 首先研究者構(gòu)建了誘導(dǎo)型降解細(xì)胞：植物生長激素誘導(dǎo)啟動（AID）表達(dá)的BRD4蛋白（Fig.1A-B），加入水稻來源的F-box蛋白Tir1，能夠降解AID后面的蛋白即BRD4（Fig.1A-B）。如Figure 1A，首先利用植物生長激素IAA處理降解蛋白后，加入4sU，再收集細(xì)胞mRNA進(jìn)行處理和SLAM-seq，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 1）BRD4降解后轉(zhuǎn)錄事件下降（Fig.1C） 2）不影響轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)TBP1和MED1水平，不影響延伸相關(guān)的CDK9, CYCLIN T1, SPT5的水平；轉(zhuǎn)錄起始相關(guān)的Pol2-S5P水平穩(wěn)定（Fig.1D） 3）轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)的修飾Pol2-S2P下降（Fig.1D） 4）Pol2、Pol2-S2P和Pol2-S5P的結(jié)合都有所下降（Fig.1E-F） 這些結(jié)果證明BRD4對于轉(zhuǎn)錄的調(diào)控并不依賴于CDK9，主要通過控制Pol2磷酸化實現(xiàn)。 Figure 1 2：BET蛋白直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄，不依賴于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和重塑過程 由于高濃度的JQ1（BETi）能夠整體降低所有mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（Fig.2A）、導(dǎo)致敏感細(xì)胞系的死亡，因此研究者采用低濃度JQ1，使得轉(zhuǎn)錄下降有了選擇性（Fig.2B）。其中發(fā)現(xiàn)一系列對BETi處理非常敏感、且抑制在AML中非常重要的基因變化顯著，包括MYC等（Fig.2C）。而CDK9抑制劑NVP-2能夠抑制轉(zhuǎn)錄的基因，則與JQ1完全不同（Fig.2D-E）。更有趣的是，同時用JQ1和低濃度NVP-2處理細(xì)胞，表達(dá)譜又同高濃度NVP-2處理比較類似（Fig.2D-E）。 關(guān)于BET蛋白的作用，有部分理論認(rèn)為是與superenhancer結(jié)構(gòu)相關(guān)。因此研究者分析了BETi下游基因與包含有SE能夠受到superenhancer調(diào)控的基因之間的關(guān)系，卻發(fā)現(xiàn)兩者并不重合，甚至于JQ1下調(diào)的基因中僅有1/3上面含有SE結(jié)構(gòu)；甚至絕大多數(shù)包含SE結(jié)構(gòu)的基因并不能被JQ1影響表達(dá)(Fig.2F-G)。例如：JQ1下調(diào)基因MYB并不含有SE；而BRD2含有SE卻不能被JQ1抑制（Fig.2G）。 接下來研究者進(jìn)一步分析BETi處理與DNA甲基化的關(guān)系。分析BETi敏感和不敏感基因TSS附近的ChIP和DNA甲基化測序結(jié)果進(jìn)行聚類和比較分析，發(fā)現(xiàn)GLM類相關(guān)度好（Fig.2H-J）。GLM這其中包括了相關(guān)性正相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、修飾，例如REST和H3K27ac（Fig.2I），也包括負(fù)相關(guān)的因子例如轉(zhuǎn)錄延伸相關(guān)的SUPT5H等(Fig.2I)。這些因子分別處于不同的功能分類中，提示了BETi對于轉(zhuǎn)錄的抑制是通過位點特異進(jìn)行，而不是通過同一個或者幾個染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)因子（Fig.2J）。 Figure 2 3：MYC能夠特異性調(diào)控生命活動關(guān)鍵基因 轉(zhuǎn)錄因子MYC是BETi作為抗腫瘤藥物最關(guān)鍵的靶點之一。而且MYC本身就是最具盛名的原癌基因之一，在白血病中MYC功能至關(guān)重要，有報道稱MYC可以起到廣泛的的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)功能[3-4]。為了分析MYC直接控制轉(zhuǎn)錄的基因，研究者同樣構(gòu)建了一個MYC蛋白誘導(dǎo)降解的系統(tǒng)（Fig.3A-B），并且SLAM-seq檢測了60min內(nèi)由MYC誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的新的mRNA，發(fā)現(xiàn)受影響的mRNA非常特異而不是如BRD4能夠影響general transcription，并且基本都是被下調(diào)（Fig.3C）。這說明MYC在此的作用并非廣泛的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)和轉(zhuǎn)錄抑制，而是特異性的轉(zhuǎn)錄激活。MYC能夠影響許多維持細(xì)胞生存必須的通路，包括核糖體形成和功能、AMP代謝、嘌呤合成等(Fig.3C-D)，因此MYC的降解會嚴(yán)重影響蛋白合成過程、AMP/GMP合成受損以及伴隨著的細(xì)胞增殖停滯（Fig.3E-F）。以上結(jié)果在其他細(xì)胞系中也得到相應(yīng)驗證（Fig.G-H）。并且尋找出的MYC下游基因與MYC的表達(dá)水平也存在很高的相關(guān)性（Fig.I-J）。 Figure 3 討論 在生物學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，技術(shù)革新總能夠帶來新的研究思路，產(chǎn)生有趣且高效的進(jìn)展。多年前的ChIP-seq，ATAC-seq等等，都是當(dāng)前表觀遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄研究中必備手段。本研究中， SLAM-seq作為一種較新的測序方式，被用來分析腫瘤細(xì)胞中BRD4、MYC對轉(zhuǎn)錄活動的調(diào)節(jié)，分析特異性的下游基因。未來可以想見，SLAM-seq這一強(qiáng)大手段能夠繼續(xù)用于單一基因下游基因和功能分析，解析例如腫瘤相關(guān)關(guān)鍵基因的真正功能。 文章來源
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