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本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)O-GlcNAcylation（O糖的乙?；┬揎椨绊懡Y(jié)腸癌（CRC）腫瘤細胞的EMT，進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。CRC轉(zhuǎn)移的病人中O-GlcNAcylation水平更高，且EZH2蛋白的穩(wěn)定性和活性更強，最終促使腫瘤細胞更容易淋巴結(jié)遷移。O-GlcNAcylation是由O-GlcNAcylation transferase (OGT)蛋白催化的。一個小RNA：microRNA-101能夠調(diào)控OGT和EZH2的轉(zhuǎn)錄后修飾和表達水平。反過來，microRNA-101的啟動子區(qū)域又能夠被EZH2催化的H3K27me3修飾，抑制其表達，從而解除microRNA-101對OGT和EZH2蛋白的抑制作用。miR-101、OGT和EZH2的反饋調(diào)節(jié)機制在CRC中起作用，影響腫瘤遷移和病人生存。

通過分析病人樣本，研究者發(fā)現(xiàn)相對于正常組織，結(jié)腸癌腫瘤組織中O-GlcNAcylation水平更高（Fig.1A-B），在細胞核和細胞質(zhì)中都有（Fig.1A）。值得注意的是，這些高的O-GlcNAcylation水平與患者年齡、性別和腫瘤發(fā)生位置等沒有關(guān)系(Table 1)，而是與腫瘤轉(zhuǎn)移程度呈現(xiàn)密切相關(guān)，導致病人更短的生存期（Fig.1C）。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中所有不同亞型的結(jié)腸癌表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)能夠催化O-GlcNAcylation的兩個酶OGT和OGA中，OGT在幾乎所有亞型中都呈現(xiàn)過度表達，相反的OGA并不會有明顯區(qū)別，說明OGT可能是與結(jié)腸癌發(fā)生、以及其中O-GlcNAcylation水平改變直接相關(guān)的關(guān)鍵蛋白（Fig.1D）；此外IHC也得到了相似結(jié)果（Fig.1E-F）。

Figure 1

檢驗不同細胞系發(fā)現(xiàn)，相對于正常腸上皮細胞，腸癌細胞系中OGT的表達水平與O-GlcNAcylation水平都更高（Fig.2A-C）；且遷移最強的細胞系LoVo和SW620中二者也最強（Fig.2A-C）。SW620中進一步過表達OGT會促進細胞遷移（Fig.2D-H），敲除則會抑制遷移（Fig.2F，I）。體內(nèi)移植瘤模型同樣證明了這一點（Fig.2J-K），即OGT修飾的O-GlcNAcylation與腸癌細胞遷移和侵襲能力正相關(guān)。

Figure 2

Figure 3A顯示，OGT敲低會導致細胞分布更緊密，失去松散的fibroblast形態(tài)；并且敲除后fibronectin和vimentin等mesenchymal標志性蛋白水平明顯下降，而E-cadherin等抑制EMT的膜蛋白水平則會大大提高（Fig.3B-D）。通過Co-IP，研究者發(fā)現(xiàn)一系列能夠與OGT結(jié)合、并且能被其催化O-GlcNAcylation修飾的蛋白，這其中包括EZH2（Fig.3E-G）。研究者進一步證明了OGT、O-GlcNAcylation水平與EZH2蛋白水平（代表穩(wěn)定性）和其催化的H3K27me3水平呈正相關(guān)（Fig.3H-I）。更有趣的是，發(fā)現(xiàn)了EZH2水平也與EMT水平呈現(xiàn)正相關(guān)（Fig.3J-M）。

Figure 3

研究者發(fā)現(xiàn)，O-GlcNAcylation修飾不僅能夠促進EZH2穩(wěn)定性，更能夠促進其與其他PRC2復(fù)合物組成蛋白，如SUZ12等的結(jié)合強度（Fig.4）。

Figure 4

預(yù)測得知miR-101/16/204/7等可能參與調(diào)節(jié)OGT轉(zhuǎn)錄后修飾，影響其表達水平（Fig.5A），且其中miR-101在不同物種中序列最保守（Fig.5B）。luciferase報告基因分析、WB等實驗也證明，miR-101既能夠抑制OGT的表達水平，也能夠影響EZH2（Fig.5C-G）。miR-101的表達會抑制細胞遷移，反之其抑制則會促進細胞遷移（Fig.5H-I）；更有趣的是，OGT或者EZH2的過表達都會部分回補miR-101導致的遷移抑制（Fig.5J）。

Figure 5

研究者發(fā)現(xiàn)，OGT和EZH2敲低后miR-101水平會上升（Fig.6A-D）。其分子原理在于，如Figure 6E-G顯示，miR-101的promoter能夠被H3K27me3修飾，因此能夠被O-GlcNAcylation、EZH2、以及H3K27me3的抗體結(jié)合并拉下。并且EZH2敲除后，這些結(jié)合都急劇下降（Fig.6H）；而當O-GlcNAcylation水平上升時，H3K27me3水平也相應(yīng)上升（Fig.6I）。

Figure 6