想知道你的目的蛋白質(zhì)是否與另一種蛋白質(zhì)交織在一起? 可以使用免疫共沉淀(Co-IP)來(lái)實(shí)現(xiàn)，然后可以通過(guò)表面等離子體共振(SPR)來(lái)發(fā)現(xiàn)它們是如何相互作用的。

Co-IP主要用于檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，是IP實(shí)驗(yàn)的一種擴(kuò)展， 基于IP反應(yīng)的潛力，在樣品溶液中捕獲和純化主要目標(biāo)（抗原等）及通過(guò)天然相互作用與靶標(biāo)結(jié)合的其他的大分子。如將蛋白質(zhì)A和抗體加入到含有蛋白質(zhì)B的細(xì)胞解液中去，利用抗體提純，若蛋白質(zhì)A，B之間有相互作用，則最后提純產(chǎn)物是抗體—蛋白質(zhì)A—蛋白質(zhì)B復(fù)合物。此外，還可以利用Co-IPs來(lái)確定在不同條件下的蛋白質(zhì)相互作用。

Co-IP與傳統(tǒng)的IP協(xié)議非常相似，其不同之處在于，需要更溫和的分析條件。一般步驟如下:

1. 裂解細(xì)胞

目的是打開(kāi)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)可以與抗體結(jié)合，裂解的方法非常重要。非去垢劑、低鹽裂解緩沖液是裂解可溶性蛋白的一種常見(jiàn)方法，這種裂解最少地干擾任何蛋白質(zhì)的相互作用。對(duì)于一些難溶的蛋白復(fù)合物，裂解緩沖液可能需要包含非離子去垢劑，如NP-40或Triton X-100。測(cè)試一些裂解條件，以找到最佳的裂解液，有時(shí)可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定。

2. 添加抗體

添加針對(duì)目的蛋白的特異性抗體。許多抗體制造商會(huì)在產(chǎn)品選擇指南中提供有用的信息。最理想的是選擇一種能識(shí)別興趣蛋白質(zhì)某個(gè)表位的抗體，且這個(gè)表位不會(huì)被任何其他蛋白質(zhì)相互作用所掩蓋。

3. 加Protein A/G珠子

Protein A/G 珠用來(lái)從混合物中提取和純化抗體/蛋白質(zhì)復(fù)合物。Protein A和Protein G是識(shí)別和結(jié)合抗體的特殊細(xì)菌蛋白，抗體的特異性將決定應(yīng)該使用哪種類型的珠子，可以咨詢抗體制造商。

傳統(tǒng)上，免疫沉淀珠是直徑為50-150uM的瓊脂糖球，通過(guò)離心分離純化抗體/蛋白復(fù)合物。現(xiàn)代技術(shù)使用直徑1-4微米的磁珠代替瓊脂珠，磁珠通過(guò)磁力作用將抗體/蛋白復(fù)合物分離。

磁珠對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)復(fù)合物和處理少量樣品有更好的效果，避免在離心過(guò)程中出現(xiàn)過(guò)多的樣品損失。瓊脂糖珠通常具有較高的產(chǎn)量，因?yàn)樗鼈儽砻娣e較大，可以結(jié)合更多的蛋白。

4. 孵育

孵育期間，珠子/抗體/蛋白發(fā)生相互作用，孵育時(shí)間由一小時(shí)到過(guò)夜不等，取決于選擇的珠子。通常，孵育時(shí)溫和地?cái)噭?dòng)，如在低速的搖臂板上，可以增加互作的機(jī)會(huì)。

5. 收集

孵育后，需要收集抗體/蛋白復(fù)合物，通過(guò)磁性或離心法將復(fù)合物與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)分離。

6. 洗珠子

清洗抗體/珠子復(fù)合體幾次，以去除與抗體非特異性結(jié)合的細(xì)胞物質(zhì)，也有助于減少粘性細(xì)胞成分與珠子的非特異性結(jié)合。一般情況下，用冷的裂解緩沖液或PBS洗滌。此步需要優(yōu)化，以找到合適的水平，不破壞蛋白質(zhì)的相互作用。保存此步中使用過(guò)的清洗buffer，如果目的蛋白和伴侶蛋白從裂解液中耗盡，清洗緩沖液可以說(shuō)明。

7. 洗脫蛋白

如果使用SDS-PAGE，可以直接添加上樣緩沖液到珠子中來(lái)獲取蛋白質(zhì)。如果想要分離的蛋白質(zhì)用于酶實(shí)驗(yàn)等，則用其他方法洗脫。一種常用的非變性洗脫液是0.1M甘氨酸，pH值較低(約2.5-3)。然而，在這些條件下，一些蛋白質(zhì)仍然會(huì)發(fā)生變性或疏松的酶活性。

8. 檢測(cè)蛋白

可以進(jìn)行SDS-PAGE，質(zhì)譜，酶實(shí)驗(yàn)，等等。

用來(lái)純化蛋白質(zhì)的抗體也在洗脫液中，這可能是個(gè)問(wèn)題。western blot可以檢測(cè)洗脫液中的抗體，如果它們分子量接近，就掩蓋了對(duì)目的蛋白質(zhì)的檢測(cè)。克服此問(wèn)題，也許可以通過(guò)使用與抗體共價(jià)結(jié)合的珠子，或者WB使用的二抗和IP二抗識(shí)別不同的種屬。

9. 使用表面等離子體共振(SPR)研究相互作用。

發(fā)現(xiàn)目的蛋白相互作用的值得興奮的，但是許多科學(xué)家被粘蛋白引入歧途。應(yīng)該做額外的研究來(lái)確認(rèn)任何潛在的相互作用，確保它們是特異性的。例如，可以使用突變分析來(lái)映射結(jié)合位點(diǎn)，或者，可以考慮使用SPR應(yīng)用。

SPR應(yīng)用不僅證實(shí)了相互作用，還提供了對(duì)親和力、熱力學(xué)的定量測(cè)量，實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。SPR生物傳感器，允許測(cè)量在不同溫度下的相互作用，便于對(duì)感興趣的相互作用進(jìn)行熱力學(xué)分析。SPR的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是，不需要標(biāo)記你的興趣蛋白，沒(méi)有更多的標(biāo)記克隆或放射性，節(jié)省時(shí)間和克隆時(shí)的潛在麻煩。如果想要檢測(cè)和闡明免疫受體和它們的配體之間的相互作用，可以考慮嘗試一種生物傳感器檢測(cè)，允許測(cè)量配體對(duì)其特定抗原受體的結(jié)合率和解離率。由于SPR的優(yōu)勢(shì)和巨大的性能，SPR及其相關(guān)應(yīng)用已經(jīng)成為動(dòng)力學(xué)和親和力測(cè)定的黃金標(biāo)準(zhǔn)，SPR原則強(qiáng)調(diào)了大多數(shù)基于顏色的生物傳感器芯片的應(yīng)用。