lncRNA之所以在科研界炙手可熱，是因?yàn)樗型ㄌ鞆氐刂?，DNA、RNA、蛋白質(zhì)均與它有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系，可介導(dǎo)胞內(nèi)各種各樣的生物學(xué)效應(yīng)。lncRNA如此全能，甚至可媲美蛋白質(zhì)，因而要研究lncRNA，一招移花接木，靈活套用蛋白研究思路，自然可以一步登天。

眾所周知，lncRNA對(duì)基因的調(diào)控可發(fā)生在基因水平、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯、翻譯后這5個(gè)環(huán)節(jié)。而細(xì)分下來(lái)，這5個(gè)環(huán)節(jié)共包含了12種能夠影響基因表達(dá)調(diào)控與功能的途徑：

基因水平

1）lncRNA參與調(diào)節(jié)DNA甲基化，甲基化需要蛋白酶催化，lncRNA可以起到穿針引線的作用。

轉(zhuǎn)錄水平

2）&3）：lncRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子以及其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的作用主要有兩種：招募（recruitment）和抑制（inhibitor），需要依據(jù)具體情況來(lái)分析促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

4）lncRNA轉(zhuǎn)錄后直接結(jié)合附近的DNA序列，抑制轉(zhuǎn)錄。該過(guò)程的特殊之處在于不依賴于蛋白，是核酸之間直接結(jié)合。

5）lncRNA可影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物以及RNA聚合酶的催化活性，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

6）lncRNA影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

轉(zhuǎn)錄后水平

7）lncRNA可結(jié)合mRNA影響可變剪切，即影響mRNA的前體加工成熟的過(guò)程。

8）mRNA加工成熟后需要轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白翻譯，而mRNA的定位也會(huì)受到lncRNA影響。

9）mRNA的穩(wěn)定性同樣受到lncRNA調(diào)節(jié)。既可結(jié)合mRNA的3’UTR誘導(dǎo)mRNA降解（類似miRNA），也可結(jié)合蛋白，再靶向結(jié)合mRNA的序列，促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性。

翻譯水平

10）lncRNA可以結(jié)合mRNA的5’UTR非翻譯區(qū)，促進(jìn)翻譯過(guò)程；也可以結(jié)合特定的蛋白靶向mRNA，抑制翻譯。

翻譯后水平

11）lncRNA可調(diào)控蛋白翻譯后修飾，比如可影響JAK-STAT信號(hào)通路的明星分子STAT3的磷酸化水平。

12）lncRNA還能調(diào)節(jié)蛋白的細(xì)胞定位，進(jìn)而影響蛋白的功能。

而依據(jù)分子作用的特點(diǎn)可對(duì)lncRNA作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮簡(jiǎn)化，并提煉總結(jié)為signal，decoy，guide，scaffold四種模式。

1）signal：信號(hào)分子。相比于蛋白，lncRNA的調(diào)控效率顯然要高。因?yàn)榈鞍仔枰诰幋a翻譯后，從胞漿再運(yùn)送到細(xì)胞核內(nèi)，才能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；而lncRNA（如反義lncRNA、eRNA）轉(zhuǎn)錄出來(lái)后可以直接結(jié)合染色體中鄰近位置的DNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，即順式調(diào)控模式（cis-regulation）。

2）decoy：誘騙。上策所講的ceRNA就是lncRNA發(fā)揮decoy作用的典型，屬于RNA-RNA直接結(jié)合的decoy。lncRNA也可以decoy蛋白，比如可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，抑制DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

3）guide：引導(dǎo)。類似伴侶分子，在RNA-蛋白-DNA三元機(jī)制模式中，lncRNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子后，可將該轉(zhuǎn)錄因子定位至特定的DNA上，從而調(diào)控下游分子的轉(zhuǎn)錄。Guide屬于典型的反式調(diào)節(jié)作用（rans-regulation），因?yàn)閘ncRNA調(diào)控的是另外一個(gè)位置的基因。

而一般認(rèn)為當(dāng)lncRNA對(duì)100萬(wàn)堿基對(duì)距離（可人為縮小為20萬(wàn)或50萬(wàn)）之內(nèi)的基因進(jìn)行調(diào)控作用時(shí)，則屬于cis調(diào)節(jié)。其實(shí)，signal和guide跟順式反式并非有著絕對(duì)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。順式、反式只看位置遠(yuǎn)近，signal、decoy、guide只看作用的特點(diǎn)。

4）scaffold：結(jié)構(gòu)骨架，指的是一個(gè)lncRNA充當(dāng)?shù)鞍讖?fù)合體的骨架，連接多個(gè)蛋白，歸屬于RNA和蛋白結(jié)合的范疇。Scaffold、guide、decoy均可以結(jié)合蛋白，其區(qū)別在于經(jīng)典的Guide模式可以連接DNA，而scaffold沒(méi)有結(jié)合DNA的戲，只結(jié)合蛋白；decoy競(jìng)爭(zhēng)的蛋白，它本來(lái)是有一個(gè)其他的結(jié)合對(duì)象的，而scaffold模式中沒(méi)有。

通常lncRNA作用機(jī)制的基本模式有兩種：1）跟RNA交互以ceRNA為主流，2）找lncRNA的互作蛋白，一般lncRNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因的啟動(dòng)子，構(gòu)成RNA-蛋白-DNA的三元結(jié)合。

其中，RNA蛋白結(jié)合是目前l(fā)ncRNA研究的重要機(jī)制方向，而且是高分文章的標(biāo)配。而針對(duì)RNA-蛋白分子交互作用的兩種不同情況可采用不同的實(shí)驗(yàn)方法。

1）從已知lncRNA找結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)方法主要是RNA pulldown，類似GST-pulldown，用帶有生物素biotin的RNA探針來(lái)捕獲lncRNA，然后用鏈霉親和素（Streptavidin）的beads結(jié)合biotin，如此親和層析后，換溶液洗脫下來(lái)的蛋白，可用質(zhì)譜鑒定或WB驗(yàn)證。

2）而從已知蛋白找lncRNA的實(shí)驗(yàn)方法則是RIP，類似ChIP，用ProteinA的beads偶聯(lián)抗體，抗體結(jié)合蛋白，蛋白把RNA沉淀下來(lái)，然后以測(cè)序/基因芯片高通量進(jìn)行篩選，或用定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

而近年來(lái)，研究RNA蛋白結(jié)合的改進(jìn)新方法也是層出不窮，如CLIP、ChIRP、CHART，它們的基本原理都是一樣的：用生物素標(biāo)記RNA，然后捕獲蛋白，用測(cè)序分析RNA或質(zhì)譜分析蛋白。

如果蛋白和RNA兩個(gè)分子都已經(jīng)鎖定，驗(yàn)證彼此結(jié)合也可以用另一種常用的核酸與蛋白相互作用的研究方法：凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA），該實(shí)驗(yàn)最初被用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與DNA相互作用。

此外，還可用蛋白芯片技術(shù)研究RNA-蛋白交互作用。通常一款蛋白組芯片上預(yù)制有大概2萬(wàn)種人全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，只需要把lncRNA用化學(xué)合成或體外轉(zhuǎn)錄方法獲取純化出來(lái)，熒光標(biāo)記后與芯片孵育雜交，而后分析芯片上哪個(gè)位置蛋白結(jié)合探針有熒光信號(hào)，就可以識(shí)別lncRNA的結(jié)合蛋白。如果是研究蛋白-蛋白相互作用，就加入標(biāo)記的蛋白樣品進(jìn)行雜交，原理一樣。

蛋白芯片已成為商業(yè)化的產(chǎn)品，好處是有公司服務(wù)，只要有l(wèi)ncRNA序列外包全套都能做下來(lái)，費(fèi)用也還好。但是它是一種純粹體外的結(jié)合體系，跟胞內(nèi)情況可能會(huì)有不同，所以存在假陽(yáng)性結(jié)果?；诖?，在通過(guò)芯片找到互作分子后，仍需要提供經(jīng)典實(shí)驗(yàn)（RIP、RNA-pulldown）的數(shù)據(jù)。

在此，推薦一個(gè)專門用來(lái)分析和計(jì)算蛋白與ncRNAs相互結(jié)合能力的數(shù)據(jù)庫(kù)catRAPID，它可根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)、氫鍵、范德華力等參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)蛋白-RNA的結(jié)合關(guān)系。

在catRAPID的模塊中，catRAPID omics應(yīng)該首先會(huì)用到。Omics可用于預(yù)測(cè)某一個(gè)lncRNA的結(jié)合蛋白，或者某一個(gè)蛋白的結(jié)合lncRNA，即只需知道lncRNA的核苷酸序列或蛋白氨基酸序列就可以了，circRNA也可以做。這個(gè)網(wǎng)站的其它模塊主要是確定了特定的lncRNA和特定蛋白組合之后，來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步分析評(píng)估兩者間相互結(jié)合的效能。

目前大部分lncRNA的文章（包括circRNA）都是以篩選結(jié)果為起點(diǎn)的，并把經(jīng)篩選確認(rèn)了表達(dá)差異以及細(xì)胞定位的lncRNA分子，進(jìn)行一正一反的功能驗(yàn)證以及細(xì)胞動(dòng)物的二次驗(yàn)證。

接下來(lái)若只研究間接機(jī)制，找明星通路和明星蛋白進(jìn)行二元或三元論證即可；而要做直接作用機(jī)制研究，則首先應(yīng)確定該lncRNA的轉(zhuǎn)錄位置和亞細(xì)胞定位。

1）lncRNA定位于核內(nèi)，先考慮附近的基因有沒(méi)有表達(dá)受影響——signal模式?；诟咄繙y(cè)序的數(shù)據(jù)，分析lncRNA表達(dá)譜和mRNA表達(dá)譜的相關(guān)性，尋找順式調(diào)控作用。

如果順式作用無(wú)結(jié)果，可考慮反式作用調(diào)控基因。此時(shí)位置沒(méi)有限制了，關(guān)鍵需要找結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，套的是guide或者decoy的模式，研究蛋白-RNA相互作用（DNA甲基化酶、組蛋白、RNA聚合酶），根據(jù)RNA pulldown篩到的蛋白來(lái)具體展開(kāi)。

2）lncRNA定位于胞漿，可以優(yōu)先考慮ceRNA，不然就要考慮lncRNA結(jié)合蛋白的作用機(jī)制，或者考慮mRNA結(jié)合影響穩(wěn)定性、可變剪切、調(diào)節(jié)翻譯、介導(dǎo)翻譯后修飾等角度。但不管是scaffold，guide還是decoy，研究RNA結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)方法從篩選到驗(yàn)證都一樣。

綜上，要想通過(guò)lncRNA、circRNA這些創(chuàng)新的分子類型，沖擊高分文章，本策移花接木就值得各位學(xué)員反復(fù)品味。下策“陽(yáng)奉陰違”將細(xì)述mRNA可變剪切的研究套路，敬請(qǐng)期待。