小管形成實(shí)驗(yàn)是測量在體外血管生成一種快速的,可量化的方法。內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合條件培養(yǎng)基并接種于基底上，易形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。之后通過軟件對小管結(jié)果進(jìn)行定量分析。

關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞小管形成的注意事項(xiàng)中。

1.一般做的多的是研究內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成。一般內(nèi)皮細(xì)胞的代數(shù)不能太多，對于HUVEC的細(xì)胞系一般多采用7代以內(nèi)細(xì)胞活力最好的時(shí)候用于成管試驗(yàn)。我們養(yǎng)的大鼠原代內(nèi)皮細(xì)胞采用的是3代內(nèi)皮細(xì)胞用于管形成的試驗(yàn)。如果細(xì)胞狀態(tài)不佳成管肯定也形成不好。

2.基質(zhì)膠。目前基質(zhì)膠都采用的是BD公司的Matrigel，目前BD的基質(zhì)膠被康寧收購了吧，所以現(xiàn)在買好像都是康寧牌的了。目前市場上基質(zhì)膠也有好幾種貨號356234、356235 等幾種。主要在于生長因子溶度上的區(qū)別。在做小管形成試驗(yàn)時(shí)注意選擇吧。

3.關(guān)于鋪膠，基質(zhì)膠比較貴，一般拿96孔板鋪的膠一個(gè)孔50ul左右，鋪膠前可以用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基對基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋的，我試過的比例為2倍吧。稀釋太多了估計(jì)內(nèi)皮細(xì)胞反而不會(huì)成管。需要注意的是96孔板底面凹凸不平本身拍照比價(jià)難聚焦，如果膠里在混入氣泡圖片會(huì)很難看，所以在鋪膠前注意下手法最好別留下氣泡。有點(diǎn)錢的可以試試24孔板鋪膠，相對拍照的區(qū)域比較大選擇的余地更多。更有錢的可以試試德國ibidi的專門做血管生成的培養(yǎng)皿，其底部是平的聚焦很準(zhǔn)，拍出來的細(xì)胞肯定在一個(gè)平面上了，。感興趣的可以試試了。具體可以參考這個(gè)帖子：

回復(fù)：ibidi血管生成實(shí)驗(yàn)步驟－實(shí)驗(yàn)方法完善版 - 丁香園論壇

4.拍照的時(shí)間點(diǎn)要把握好，一般內(nèi)皮細(xì)胞在12h內(nèi)成管吧。24h后可能管狀結(jié)構(gòu)趨于崩解。所以一般拍照基本會(huì)在12h內(nèi)完成。具體的可以多踩點(diǎn)。

5.細(xì)胞數(shù)，掌握好鋪板的密度，細(xì)胞密度太低難以成管，細(xì)胞密度太高也會(huì)不成管的。

6.生長因子，如果內(nèi)皮細(xì)胞在膠上難以成管可以試試在培養(yǎng)基中加點(diǎn)vegf等生長因子有利于內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成。

7.如果需要也可以進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的染色如圖：

8.關(guān)于管形成結(jié)果的定量分析，目前都普遍通過軟件進(jìn)行定量分析如IPP或image J等。

具體見

Matrigel血管生成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析？ - 丁香園論壇

其中8樓為IPP軟件的定量分析，帖子中有網(wǎng)盤下載包含血管生成分析插件的image J安裝包，需要的可以自己下載。

最后總結(jié)一下血管生成的試驗(yàn)步驟，僅供參考用：

1。試驗(yàn)前一天，96孔板、基質(zhì)膠、需用到的槍頭（一般200ul的吧）4度進(jìn)行預(yù)冷或溶解。一般基質(zhì)膠如果分裝的小量的話可以試驗(yàn)前2個(gè)小時(shí)左右開始4度溶解，可以放在冰袋上進(jìn)行溶解。

2.預(yù)冷的槍頭吸取50ul左右的基質(zhì)膠到96孔板中，可以在冰上進(jìn)行，別讓基質(zhì)膠受熱。別有氣泡。

3.96孔板放入培養(yǎng)箱中凝膠30min、

4.在凝膠的等待中，消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，時(shí)間剛剛好，加藥組可以此時(shí)與細(xì)胞共混進(jìn)行處理。

5.96孔板開始添加細(xì)胞懸液，一個(gè)孔50ul的細(xì)胞懸液，同樣注意別有氣泡進(jìn)去了。槍頭別觸碰到膠。

6.培養(yǎng)一段時(shí)間后拍照，同樣可以根據(jù)需要進(jìn)行calcein熒光染色。

7.拍照，圖像分析。